本文来源于微信公众：生物制品圈 作者：彪彪
摘要：大肠杆菌（E. coli）作为重组蛋白生产的主力宿主，其包涵体（IBs）的生物工艺开发是提升生物药产率与活性的关键。本文系统综述了包涵体从上游表达至下游回收的全流程技术，包括发酵工艺优化、包涵体形成机制、溶解与复性策略及纯化技术创新。研究指出，通过优化诱导条件（如温度、pH、诱导剂浓度）和采用温和溶解剂（如低浓度尿素结合表面活性剂）可显著提升活性蛋白回收率，而色谱柱复性与微流控技术为工业化生产提供了新方向。
一、大肠杆菌包涵体：生物制药的 “潜力宝库”
大肠杆菌因高表达效率成为重组蛋白生产的首选宿主，但其表达的蛋白常以包涵体形式存在 —— 一种由错误折叠蛋白聚集形成的不溶性颗粒。尽管包涵体曾被视为 “生产障碍”，但其高稳定性、抗蛋白酶降解及低杂质污染的特性，反而成为规模化生产的优势。例如，通过优化发酵条件，包涵体可占细胞总蛋白的 30% 以上，且下游纯化步骤可简化（图 1）。当前，约 120 种获批生物药（如胰岛素、细胞因子）均通过包涵体工艺生产，凸显其在生物制药中的核心地位。
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二、上游工艺：从发酵到包涵体形成的关键调控
2.1 发酵模式与参数优化
分批补料发酵：相较于传统分批发酵，补料模式通过控制底物（如甘油、葡萄糖）添加，可避免乙酸积累导致的生长抑制。例如，补料发酵使羊生长激素产量从 60 mg/L 提升至 3.2 g/L（表 1）。
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诱导条件：
温度：低温（18–25°C）抑制疏水聚集，形成更小、更易复性的包涵体；高温（42°C）导致淀粉样结构形成， solubility 下降（表 1）。
pH 与渗透压：酸性环境（pH <5.5）促进包涵体形成，而中性 pH（如 7.4）减少聚集（图 1）。
诱导剂：IPTG 浓度过高（>1 mM）会加剧细胞应激，推荐低浓度（0.1–0.8 mM）结合早期诱导策略。
2.2 宿主与载体设计
工程菌株：敲除硫氧还蛋白还原酶（trxB）和谷胱甘肽合成酶（gor）的菌株（如 SHuffle、Origami）可营造胞内氧化环境，促进二硫键正确形成。
表达载体：新型载体（如 pAR-KanI、pCR2）无需抗生素筛选，稳定性高，适合工业化生产。T7 启动子虽转录效率高，但易导致蛋白错误折叠，需搭配分子伴侣共表达。
三、下游工艺：从包涵体到活性蛋白的 “重生之路”
3.1 分离与清洗
细胞破碎：高压均质（French press）与超声破碎为常用方法，结合溶菌酶（1 mg/mL）可提升破碎效率。例如，超声破碎后通过离心（10,000 g）可有效分离高密度包涵体（密度 1.3 mg/mL）。
清洗策略：使用低浓度尿素（2 M）或去污剂（Triton X-100）清洗 3–4 次，可去除膜碎片与宿主蛋白，获得纯度 > 90% 的包涵体。
3.2 溶解与复性：平衡效率与活性的核心
溶解剂选择：
强变性剂：8 M 尿素或 6 M 盐酸胍可完全溶解包涵体，但需注意尿素分解产物对蛋白的毒性。
温和方法：3 M 尿素结合 0.2% Sarkosyl（N - 月桂酰肌氨酸钠）可保留部分天然结构，直接稀释后复性效率提升 30%（表 3）。
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复性技术：
色谱柱复性：利用尺寸排阻色谱（SEC）或离子交换色谱，在脱除变性剂的同时促进正确折叠，如 EGF 复性产率达 76%。
微流控技术：通过微通道内的层流扩散精确控制变性剂浓度梯度，适用于难复性蛋白（如柠檬酸合酶），复性效率提升至 93.5%（表 4 上一篇：人类多能干细胞治疗：正在成长中的巨人 下一篇：金沙浦归，魔幻之都|上海校园巡展圆满落幕！
