文章来源公众号：细胞与基因漫谈 作者：小土豆豆
最近In vivo CAR-T比较火热，mRNA在in vivo CAR-T细胞疗法中的应用前景广阔，主要因其瞬时表达、安全性高、递送灵活等特点，能够克服传统ex vivo CAR-T的诸多限制，如复杂制备流程、高昂成本及长期毒性问题。通过mRNA生成的CAR-T细胞，可以在T细胞中诱导短暂的CAR表达，可以减轻与病毒载体相关的不良反应。
纳米递送系统以纳米颗粒包裹靶向肿瘤相关抗原的mRNA，一方面能直接靶向T细胞生成CAR-T细胞，直接作用于相应肿瘤细胞；另一方面可以通过靶向递送至抗原提呈细胞，辅助性增强CAR-T 细胞功能，进一步诱导对肿瘤细胞产生特异性免疫反应。
1. mRNA纳米递送系统的优势
（1）更高的生物安全性。病毒载体通过随机整合到宿主细胞基因组，存在插入突变风险。mRNA 纳米载体无需整合到宿主细胞基因组。
（2）更具有可控性。mRNA纳米载体可以介导基因的瞬时表达，可通过调节给药次数和给药剂量实现更加精准的调控。
（3）更好的操作性。可以在纳米载体表面偶联特异性抗体分子，使其更加精准地修饰细胞。
（4）更高的翻译效率。mRNA在细胞质即可翻译成蛋白质。
（5）更快的制备速度。mRNA可快速合成。
（6）更高效的规模生产。mRNA纳米载体的两大组成部分，mRNA序列和纳米递送载体均可以进行批量生产。
（7）自我免疫佐剂功能。mRNA纳米载体自身可以激活机体的固有免疫。
（8）更加灵活多样的设计潜能。
2. mRNA纳米递送系统的结构设计与合成
mRNA纳米递送系统主要由mRNA和纳米递送载体组成。通过对mRNA的结构和序列进行优化，能够提高其编码的蛋白的表达效率；纳米递送载体能够保护mRNA不被RNA酶降解并可以实现精准靶向作用。
(1) mRNA的结构与优化
mRNA通常采用线性DNA模版体外转录的方式获得，mRNA包含5个组成部分：5,-帽结构、5,非翻译区（5,UTR）、编码阅读框（ORF）、3,非翻译区（3,UTR）、3，poly(A)尾。mRNA的摄取效率、胞内稳定性、翻译效率是影响mRNA递送效率的重要因素，因此，可以对mRNA进行结构优化。
（2）脂质纳米颗粒载体材料
在CAR-T细胞治疗中，递送载体材料主要包括脂质纳米颗粒（LNP）、多聚物、多肽/蛋白质、混合纳米颗粒等。通常纳米材料表面可以连接特异性抗体分子。在脂质纳米递送系统中使用较多的是脂质纳米颗粒(LNP)和脂质复合体(LPX)。LNPs通常包含4个基础成分：可电离的脂质、胆固醇、辅助磷脂和聚乙二醇(PEG)。
（来自于：Nano Lett. 2020 Mar 11;20(3):1578-1589.）
LNPs的形成机制是在酸性条件下，带正电的可电离脂类与带负电的核酸通过静电作用结合，在胆固醇和辅助脂质的辅助下，形成稳定的单层磷脂层。胆固醇的主要作用是增强脂质纳米颗粒的稳定性，协助膜融合，促进mRNA进入细胞质。辅助磷脂一般为饱和磷脂，可以提高纳米颗粒的整体相变温度和稳定性。PEG可以改善LNPs的稳定性，并阻止巨噬细胞介导的吞噬。可电离脂质是胞质中最关键的赋形剂和决定因子，通过电离释放mRNA。对LNPs 的原料及配比进行优化，发现原料的修饰和配比会显著影响mRNA 的递送效率。
3. 基于mRNA-LNP的In vivo CAR-T的核心优势
传统的体外CAR-T细胞生产流程包括单采物提取、体外T细胞分选、病毒载体制备、体外转导、扩增培养、收获等过程，生产周期较长且成本高昂。通过脂质纳米颗粒递送编码CAR的mRNA至体内，在体内生产CAR-T细胞，它具有以下优势：
（1）简化了CAR-T细胞的生产流程，降低生产成本。mRNA-LNP递送可直接注射，在体内重编程T细胞，省去体外步骤，生产周期缩短至1-2天，成本大幅降低。例如Capstan Therapeutics的CPTX2309（抗CD19 mRNA CAR-T）已进入I期临床，采用靶向LNP递送，实现“即用型”治疗。（关于Capstan Therapeutics的In vivo CAR-T文章，可查看往期文章）。
（2）具有更高的安全性。首先，mRNA不整合基因组，仅短暂表达（数天至1周），避免长期毒性（如插入突变、持续免疫激活）。此外，可多次给药调节疗效，减少细胞因子风暴的风险。
（3）拓展适应症。例如从血液瘤到实体瘤的应用，传统CAR-T细胞对实体瘤效果有限，mRNA可多次注射维持T细胞活性，或联合免疫检查点抑制剂增强其肿瘤浸润能力。此外，还可以用于自身免疫病，如系统性红斑狼疮、类风湿关节炎，以及纤维化疾病：如心衰、肝纤维化。
4. 脂质纳米颗粒递送mRNA的不足
脂质纳米系统是目前被认为最理想的递送系统，也存在局限性，如（1）脂质纳米系统的毒理学效应和有效载荷的组织分布仍未研究清楚，其安全性受到质疑；（2）脂质纳米系统的免疫原性较强，脂质纳米系统成分可诱导免疫应答；（3）由于mRNA表达短暂，导致其药效持久性不足，需优化剂量。
基于LNP递送mRNA在体内生成CAR-T细胞代表了一个新一代细胞治疗范式，其快速、安全、可扩展的特性有望使CAR-T细胞疗法从“高值小众”迈向“普惠疗法”。随着LNP递送和mRNA设计的进步，未来5年内可能见证首款上市产品，重塑癌症、自身免疫病及纤维化疾病的治疗格局。
