一、CAR-T的发展历史

1993年，第一篇CAR-T的论文诞生了。仔细拜读了一下这篇文章，麻雀虽小五脏俱全啊，有针对半抗原TNP的scFv（单链抗体），也知道了CD3ζ的独立性，从而构建出这段质粒。

诶，他们是怎么想到的用scFv呢？其实他们之前做的是给T转染VH+VL两段基因从而靶向肿瘤抗原。但是很显然，在没有电转技术的时候，逆转录病毒转导T就容易死，想要完成两段基因共转染，T完全是在劫难逃啊。

于是呢，他们希望只转一段基因进去，这样的转染效率会提升很多。但是这样要求单基因编码整个抗原结构域。

具体要怎么做呢？他们将目光转向了微生物学。微生物学发现：像大肠杆菌这样的原核生物也是可以产生抗体的，这个似乎完美符合了他们想要做的事——让单基因编码抗原结构域。

借鉴了细菌表达系统的单链抗体技术，其核心是通过基因工程手段将VH和VL用柔性连接肽（Linker）融合。最终形成如图所示的scFv-γ或scFv-ζ嵌合基因。

第二代的CAR-T引入了共刺激信号CD28 or 4-1BB。这个很好理解，第一代的CAR-T只能让T去识别抗原（传递第一信号）。而第二代引入了共刺激信号（第二信号）。

这个改进的效果非常优秀，成为了被FDA批准上市的CAR-T药物。这种CAR-T已经能够很好地治疗血液肿瘤。

而第三代的改进，个人认为非常失败啊，非常简单粗暴地把CD28和4-1BB串连在一起。

这个方法的初衷是希望通过增强共刺激信号，希望能够提高CAR-T的效果。但是实验研究表明：把多个共刺激信号串连在一起，并不能提高CAR-T的疗效，相反，还可能导致T细胞的耗竭与外周细胞毒性。

这个方法是效果极其一般，以至于第四代的CAR-T都没有采用。

这个失败给了我们一个教训：CAR-T的核心问题在于平衡疗效与安全性。而提升疗效需要做的是精准调控，而非信号通路的野蛮叠加！

第四代的CAR-T在第二代的基础上，新增了一个免疫调节信号（可以叫广义的第三信号吧），它希望解决的是实体瘤中肿瘤微环境的免疫抑制问题。

具体来说，增添的免疫调节信号最常见的是分泌细胞因子如IL-12, IL-15, IL-7等，有的也敲入趋化因子受体如CCR4。需要解决哪些问题来确定增添什么。

二、CAR-T的结构

scFv由抗体的重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）通过一段柔性短肽连接组成。它识别的是细胞表面的抗原。这也就引出了CAR-T的第一个缺陷：

①必须识别细胞表面的抗原，无法识别肿瘤特异性的新抗原（neoantigen）。而既然针对的是肿瘤相关抗原（TAA），就需要避免外周毒性的发生。

CAR-T的靶点在血液肿瘤中有CD19，BCMA。但是在实体瘤中，好像没有完全令人满意的靶点。像HER2，MAGE-4，CEA，PSMA等等靶点，就需要解决on-target off-tumor毒性、抗原逃逸、肿瘤浸润不足，免疫抑制微环境这些问题。

此外，相比于天然抗体，人工合成的单链抗体scFv由于没有恒定区，导致VH/VL通过疏水作用相互结合，形成寡聚体（尤其是二聚体）。当scFv寡聚后，下游的信号通路就被激活了，而这种信号的强度相对于与肿瘤抗原结合来说是偏低的。这会导致T细胞呈现耗竭状态。这是CAR-T的第二个缺陷：

②scFv易形成寡聚体，导致T细胞耗竭。当然已经有研究试图解决这一点，包括改进CAR的结构，只要一段VH不要VL即可识别等等。

CD3ζ在CAR-T当中的作用是模拟体内的TCR/CD3复合物的功能，给T细胞传递信号。相比于整个TCR/CD3复合物，CD3ζ传递信号的能力没有那么强，也就是说只依靠CD3ζ不能有效维持T细胞的增殖活化。

这个的解决方法早已被人提出了：增加CD28 or 4-1BB作为共刺激信号。

CD28由于激活NF-κB通路，它的特点是诱导的T细胞大量分泌IL-2，有很强的细胞毒性。

4-1BB则是激活NFAT信号，它的特点是诱导的T细胞分泌细胞因子的水平不高，但能维持很强的记忆表型。

如果需要短效而强力激活，就用CD28，如果想要持久激活，就用4-1BB。

这个图讲得非常清楚：

①针对肿瘤中有抗原表达的部分，CAR-T分泌穿孔素和颗粒酶，诱导肿瘤裂解。

②针对肿瘤中没有抗原表达的部分，CAR-T通过Fas-FasL通路诱导肿瘤凋亡。

③针对肿瘤微环境中的基质细胞（其实也可以针对肿瘤），CAR-T通过释放细胞因子（例如IFN-γ），提高CAR-T的活性。