文章来源公众号：南风夜谈           作者：南风夜谈编

嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法是一种“活药物”，在该疗法中，患者的T细胞经过基因工程改造，表达一种人工受体，该受体可引导T细胞攻击病变细胞。CAR T细胞疗法已产生显著影响，为部分既往无法治疗的晚期癌症患者带来了治愈可能。然而，该疗法仍存在局限性，包括严重毒性、工程化细胞存活期有限以及治疗耐药性。为解决这些局限性，研究人员开发了基因编码的小分子调控系统。这类系统可通过清除CAR T细胞或关闭其功能来阻断毒性反应；此外，还可通过直接靶向抗原或激活细胞毒性前药以扩大细胞杀伤能力，从而增强治疗效果。小分子调控剂包括蛋白酶抑制剂、蛋白二聚化剂、蛋白降解剂、双特异性衔接子以及条件激活型化疗药物。本文概述了基于小分子的调控策略，按功能对其进行分类，并详细阐述其分子机制；重点介绍了进入临床阶段的系统，同时强调了新兴应用领域及尚未满足的需求。

图1 | CAR T细胞简介、不足及小分子调控解决方案。a，嵌合抗原受体（CAR）T细胞通过CAR基因的病毒转导制备。CAR由单链可变片段（scFv）抗原结合结构域与T细胞信号结构域融合而成。患者接受CAR T细胞输注后，CAR与抗原结合，进而介导抗肿瘤功能。b，CAR T细胞疗法面临的挑战主要包括不良毒性反应和治疗效能有限。如连接线所示，多种小分子调控方法正用于解决这些挑战。CD3，分化簇3。

    尽管CAR T细胞疗法具有优势和应用前景，但多项挑战限制了已获批疗法的疗效，并阻碍其向更多疾病适应证拓展。总体而言，这些障碍可分为安全性和治疗效能两大类。CAR T细胞疗法的毒性反应和副作用仍是亟待克服的主要障碍。免疫激活水平过高引发的全身性毒性包括：细胞因子释放综合征（一种可能导致多器官系统毒性的全身性炎症反应）、细胞因子风暴（由非特异性T细胞激活介导，导致γ-干扰素和肿瘤坏死因子释放）、神经毒性（包括CAR T相关脑病综合征）、噬血细胞性淋巴组织细胞增生症以及血细胞减少症。针对白细胞介素-6（IL-6）及其受体的药物（分别为西妥昔单抗和托珠单抗）常被用于阻断细胞因子释放综合征。然而，许多毒性反应可能致命，仍是重大关切问题。

    另一毒性来源是CAR T细胞攻击表达靶抗原的正常细胞，这种情况被称为“脱靶-肿瘤外毒性”。例如，已获批的抗CD19 CAR T疗法不仅靶向肿瘤细胞，还会靶向表达CD19的正常B细胞，导致B细胞再生障碍（一种暂时性B细胞缺失），可通过输注混合免疫球蛋白缓解。不幸的是，其他由CAR T细胞介导的“脱靶-肿瘤外毒性”案例后果更为严重，已导致器官功能障碍甚至死亡。

    此外，近期有研究关注CAR T细胞疗法相关的继发性恶性肿瘤，包括工程化细胞可能发生的恶性转化。在接受CAR T细胞治疗的患者中观察到继发性恶性肿瘤后，FDA已在获批疗法的说明书中添加黑框警告。然而，多项大型研究尚未发现CAR T细胞发生转化的证据；此外，最新数据表明，CAR T治疗可能不会增加继发性恶性肿瘤的发生率。值得注意的是，一种通过非病毒转座子载体递送的疗法已导致细胞恶性转化，这一结果凸显了对新型递送方式进行安全性评估的重要性。

    获得足够治疗效能的挑战与毒性问题相互关联。影响效能的一个关键因素是病变部位CAR T细胞的数量，该数量受输注细胞剂量以及CAR T细胞在患者体内的增殖和存活情况影响。尽管传统上CAR T细胞在激活后会发生增殖，但长期激活、过度激活或缺乏适当辅助共信号激活的细胞，可能会发生程序性细胞死亡或细胞耗竭。持续性信号传导（CAR在无抗原情况下发生低水平聚集）是导致T细胞长期激活的主要原因之一，这会使受体产生基础活性，进而导致细胞早期耗竭。此外，病变细胞或辅助性免疫抑制细胞释放的免疫抑制信号，可直接抑制CAR T细胞的功能。然而，影响CAR T治疗效能的另一主要挑战是肿瘤组织内的抗原丢失或抗原异质性，这些问题会导致病变细胞无法被彻底清除。与小分子靶向药物的治疗失败类似，在CAR T细胞治疗后疾病复发的患者中，频繁观察到由靶基因突变和潜在抗原异质性引发的耐药机制。

    CAR T细胞疗法独特的单次给药方式，进一步增加了医生应对CAR T细胞毒性的难度。传统药物可通过调整剂量和可预测的代谢过程实现精细的药代动力学调控，而CAR T细胞疗法作为“活药物”，会在体内扩增，且不同患者间细胞的存活时间存在差异。此外，患者接受CAR T细胞输注后，目前尚无获批方法能让医生在体内选择性调控工程化细胞的行为或清除它们。

    因此，下一代CAR T细胞设计的核心方向之一，是开发能在输注后快速、可调控地控制CAR T细胞功能的技术。通常，这类系统由CAR T细胞中的一种或多种蛋白质构成，这些蛋白质可在临床医生提供的输入信号刺激下被激活或抑制。研究人员已开发出响应多种输入信号的“远程调控”系统，包括小分子、机械力、磁力、热和光。这些广泛的调控策略已有相关综述报道。

    小分子调控系统因其诸多优势而备受关注。小分子是现代药理学的基石，具有可预测的动力学和生物分布特征。现有小分子种类丰富，可实现多种功能，包括病毒蛋白酶抑制剂、蛋白二聚化剂、蛋白水解靶向嵌合体（PROTACs）、双功能衔接子以及条件激活型化疗药物和激酶抑制剂。此外，许多已获FDA批准的小分子药物，可通过在系统设计中整合已知的相互作用蛋白结构域，重新用于CAR T细胞调控。与光、热或磁力等其他输入方式相比，小分子药物给药相对简便，无需复杂设备，且有望实现口服给药。小分子工具的广泛性还使其能够通过组合应用，实现对多种细胞行为的多输入和正交调控。图2展示了目前已用于调控的部分小分子，包括其结构、分子功能、靶蛋白及应用场景。补充表1列出了化合物名称及其PubChem化合物标识和化学文摘社登记号。已开发的小分子系统的目标主要分为四大类：CAR T细胞清除、CAR表达或组装调控、抗原靶向以及辅助基因功能调控。

图 2 | 用于调控 CAR T 细胞的小分子化学结构。本综述中讨论的部分小分子结构如图所示。小分子按功能分组，并提供以下补充信息：化合物名称（FDA 批准年份）、相互作用蛋白结构域，以及小分子嵌合抗原受体（CAR）系统的应用类型（由图例中定义的彩色星号标注）。对于因与其他显示分子（黑色文本）结构相似而未展示结构的分子，也提供了上述信息（灰色文本）。Bcl-XL，B 细胞淋巴瘤超大蛋白；Bim，Bcl-2 相互作用死亡介质；BRD4，含溴结构域蛋白 4；CRBN，cereblon 蛋白；DUPA，2-[3-（1,3 - 二羧丙基）脲基] 戊二酸；eDHFR，大肠杆菌二氢叶酸还原酶；ERT2，他莫昔芬响应型雌激素受体结构域；FITC，异硫氰酸荧光素；FKBP12，12 kDa FK506 结合与雷帕霉素结合蛋白；FOLR1，叶酸受体 1；FRB，FKBP - 雷帕霉素结合结构域；GAI，赤霉素不敏感蛋白；GID1，赤霉素不敏感矮化 1 蛋白；HCV，丙型肝炎病毒；HSV，单纯疱疹病毒；IKZF3，IKAROS 家族锌指蛋白 3；NS3，非结构蛋白 3；POM，泊马度胺；PSMA，前列腺特异性膜抗原；scFv，单链可变片段；sdAb，单域抗体；tBu，叔丁基；TetR，四环素阻遏蛋白；TetRB，四环素阻遏蛋白 B；TMP，甲氧苄啶。

    理想的小分子调控系统具有一些共同特征：采用生理惰性的小分子诱导剂（具有良好的药代动力学和药效学特征）、可滴定、可逆，且其效应功能至少不低于标准CAR T细胞。CAR T细胞的小分子调控技术发展迅速，多种方法已进入临床评估阶段（包括 NCT03373097、NCT03016377 和 NCT02744287）。补充表2列出了本文发表时已注册的临床研究。

    本文综述了当前及新兴的CAR T细胞小分子调控技术，按系统目标分类组织内容。在每个部分中，我们将介绍分子系统设计、基于小分子的调控机制以及每种方法的技术能力，同时讨论其临床转化的适用性（包括当前局限性）；此外，还将探讨当前小分子系统未来的新兴应用领域，以及新型合成化学发展中亟待满足的关键需求。

Box 1 CAR T细胞疗法基础

    嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法是一种免疫细胞疗法，通过基因修饰T细胞使其表达CAR，再将其输注到患者体内，以启动针对病变细胞的免疫攻击。CAR T细胞疗法备受关注，因其对晚期血液系统恶性肿瘤展现出强效抗肿瘤效应，而化疗、靶向药物等其他疗法对这类肿瘤往往无效。此外，该疗法利用人体自身清除病变细胞的天然机制，且具有“免疫记忆”潜力，可持续预防癌症复发——这一特性与人体在既往感染或接种疫苗后能更轻松清除感染的能力类似。

    CAR是经工程化改造的细胞表面受体蛋白，可响应邻近靶细胞表面的抗原，调控免疫细胞（CAR T细胞疗法中为T细胞）的信号传导和效应功能。CAR具有嵌合性，由不同来源的结构域融合而成：最远端是胞外抗原结合结构域，负责识别靶细胞上的抗原；该结构域通过胞外间隔区（负责确定结合结构域与T细胞膜的距离，是信号传导的关键参数）与跨膜结构域（使受体定位于细胞膜）融合；胞内部分为细胞质信号结构域，负责激活T细胞受体（TCR）和共刺激信号通路。

大多数CAR设计采用抗体的单链可变片段（scFv）作为抗原靶向结构域，以TCR的“CD3ζ”细胞质结构域作为信号结构域；多数设计还包含共刺激细胞质信号结构域（如CD28或4-1BB），可为T细胞提供存活和扩增信号。与邻近细胞上的靶抗原结合后，T细胞表面会产生机械力并引发CAR聚集，这种聚集会触发T细胞受体和共刺激信号蛋白的激酶磷酸化级联反应，进而导致钙内流、靶细胞裂解、激活的CAR T细胞增殖，同时启动基因表达程序（包括表达γ-干扰素、肿瘤坏死因子等炎症细胞因子）。

T细胞受体需在主要组织相容性复合体（MHC）的背景下识别靶抗原，这要求人类白细胞抗原（HLA）配型——类似器官移植中供体与受体的配型。相比之下，CAR可直接结合细胞表面抗原，因此其功能不依赖HLA配型。

CAR T细胞疗法属于“过继性细胞疗法”，即CAR T细胞在体外制备后，过继转移回患者体内。目前CAR T细胞的制备策略仍在研发中，但已获批的疗法均遵循类似流程：通过白细胞分离术采集患者血液并分离T细胞；利用逆转录病毒或慢病毒转导将CAR基因导入患者T细胞；随后在体外扩增细胞（约100-1000倍），最后输注给患者。

目前已有7种CAR T细胞疗法获FDA批准，其中5种靶向CD19，用于治疗复发或难治性B细胞白血病和淋巴瘤；2种靶向BCMA，用于治疗复发或难治性多发性骨髓瘤。由于实体瘤占癌症病例的大多数，将CAR T细胞疗法应用于实体瘤是当前的研究热点。此外，多项临床试验显示，该疗法在严重自身免疫性疾病中也能产生显著的临床应答。

CAR T细胞的清除

    首个应用于CAR T细胞的小分子调控系统是“自杀开关”，其目的是在给予药物后特异性清除CAR T细胞。该策略的设计初衷是作为一种安全开关，为CAR T细胞介导的危及生命的毒性提供紧急补救措施。理想的自杀开关应具备以下特征：快速（在检测到初始毒性后能立即停止进一步毒性作用）、特异性（仅清除CAR T细胞，不影响其他细胞）、可滴定（可部分终止效应，调控活性，使部分CAR T细胞得以保留）。总体而言，由于自杀开关会永久性清除CAR T细胞，可能导致抗肿瘤应答不可逆减弱，因此它更适合作为应对极端情况的补救机制。正因如此，自杀开关作为评估毒性谱未知的新型CAR T细胞策略的“故障保险”机制，备受关注。

    最早开发的自杀开关是单纯疱疹病毒1型胸苷激酶（HSV-TK）系统。该系统由抗病毒药物更昔洛韦（一种鸟苷核苷类似物）调控。HSV-TK是更昔洛韦的靶基因，将其导入CAR T细胞后，可使CAR T细胞对更昔洛韦产生致死性敏感。全身性给予更昔洛韦后，HSV-TK将其磷酸化为单磷酸核苷，内源性细胞激酶进一步将其磷酸化为三磷酸核苷。这种代谢产物可竞争性抑制鸟苷掺入DNA，干扰DNA合成，最终导致细胞死亡。在人白血病和实体瘤异种移植小鼠模型中，表达HSV-TK系统的CAR T细胞显示出抗肿瘤效能；重要的是，实体瘤研究表明，更昔洛韦可有效清除CAR T细胞并降低其活性。尽管HSV-TK系统已在多项临床试验中开展研究，但由于未出现CAR T毒性，该系统未被激活，因此其激活效果尚未得到研究。HSV-TK系统存在一些局限性，例如需依赖细胞主动复制才能诱导死亡，导致细胞清除不完全，且细胞清除动力学较慢（需3–5天）；此外，还观察到针对病毒来源HSV-TK基因的免疫原性，可能导致细胞在药物清除前就被机体清除。不过值得注意的是，在CAR T细胞试验中未观察到免疫原性。HSV-TK还被用于另一项临床应用：作为报告基因，通过正电子发射断层扫描（PET）对CAR T细胞进行成像。在该应用中，研究人员向胶质母细胞瘤患者施用了氟-18放射性标记的喷昔洛韦类似物——9-[4-[18F]氟-3-（羟甲基）丁基]鸟嘌呤（[18F]FHBG），结果表明该系统安全有效，可用于CAR T细胞存活情况和定位的纵向追踪。

    目前最成熟的CAR T细胞清除开关是诱导型半胱天冬酶9（iCasp9）系统。该系统利用二聚化化学诱导剂（CID）利米度昔（AP1903）或其类似物AP20187激活促凋亡酶半胱天冬酶9。利米度昔是一种可穿透细胞的他克莫司类似物，可特异性结合并使FK506结合蛋白（FKBP12）的F36V突变体发生同源二聚化。它与野生型FKBP12的结合力弱1000倍，因此不会抑制雷帕霉素靶蛋白（mTOR）激酶，具有生理正交性。在CAR T细胞中表达的iCasp9蛋白，其半胱天冬酶募集结构域被FKBP12F36V取代。加入CID后，iCasp9发生同源二聚化，触发凋亡信号级联反应。在人类临床试验中，iCasp9系统是所有CAR T细胞小分子调控系统中应用最广泛的（46项试验中有38项使用；补充表2）。该系统显示出显著效能：单次给予利米度昔或AP20187后，可在30分钟内快速清除细胞，清除率高达95%。它能够清除患者血液和中枢神经系统中的CAR T细胞，并缓解毒性反应。在其他多项研究中，iCasp9开关虽已导入但未被激活，这些研究证实iCasp9系统具有安全性，且不会对CAR T细胞的治疗效能产生负面影响。在另一项研究中，iCasp9系统还被证明具有可滴定性：低剂量利米度昔可缓解毒性，同时允许CAR T细胞在后续重新扩增并恢复抗肿瘤功能。由于iCasp9源自人类，因此基本无免疫原性。尽管该系统的清除效率足以缓解多种毒性，但对于严重的“脱靶-肿瘤外毒性”，其清除效果可能仍不足。

图3 | 清除CAR T细胞的小分子策略。a，靶向清除CAR T细胞的原理：CAR T细胞被工程化改造，导入可使其对小分子药物敏感的基因构建体，而非工程化的内源性细胞则不受影响。b，三种小分子介导的细胞清除系统：HSV-TK将更昔洛韦磷酸化，随后细胞激酶进一步将其磷酸化为强效DNA聚合酶抑制剂；利米度昔使iCasp9发生二聚化，雷帕霉素使RapaCasp9发生二聚化，进而启动半胱天冬酶级联反应，触发凋亡。CAR，嵌合抗原受体；Casp9，半胱天冬酶9；FKBP12，12 kDa FK506结合与雷帕霉素结合蛋白；FRB，FKBP-雷帕霉素结合结构域；HSV-TK，单纯疱疹病毒胸苷激酶；iCasp9，诱导型半胱天冬酶9；RapaCasp9，雷帕霉素激活型半胱天冬酶9。

    iCasp9系统的一个局限性是，利米度昔和AP20187均未获FDA批准。“RapaCasp9”是另一种iCasp系统，它使用已获FDA批准的免疫抑制剂——大环天然产物雷帕霉素进行调控。在体外实验和临床前模型中，RapaCasp9显示出强效清除活性。雷帕霉素与其天然靶点mTOR的相互作用可能是一个潜在问题，但细胞清除所需的单次给药剂量通常具有良好耐受性，且其免疫抑制活性在缓解免疫毒性方面可能具有优势。因此，该系统具有较高的临床应用潜力。

CAR表达或组装的调控

    缓解CAR相关毒性的另一种策略是利用小分子调控CAR蛋白的表达或组装。与自杀开关不同，该策略可保留治疗性细胞，并实现CAR T细胞激活的可逆性和时效性调控，同时还有可能改善T细胞的活性。抗原介导的T细胞长期激活或持续性受体信号传导，可能导致T细胞耗竭并最终发生凋亡；通过小分子调控使CAR信号“暂停”，已被证实是缓解这一问题、提升抗肿瘤效能的有效方法。

    凭借这些优势，直接调控CAR的小分子系统已成为目前临床前研发的主要方向。研究人员开发了“开启”开关（小分子诱导CAR表达）和“关闭”开关（小分子清除或灭活CAR），其中许多系统可实现精细调控。然而，值得注意的是，若要维持长期活性，需频繁、重复给予小分子药物。如下所述，研究人员已开发出多种独特的CAR开关系统设计，这些系统虽有诸多共同特征，但其关键差异使其适用于特定场景。

图 4 | CAR 表达及组装的小分子调控机制。a，CAR T 细胞 “开启” 开关的原理及系统设计。小分子药物可诱导功能性 CAR 表达，并能调控其表达水平。值得注意的是，CAR 激活还需抗原参与，该系统遵循 “[抗原] 与 [小分子]” 的布尔逻辑传导信号。系统设计包括：组装调控（二聚化剂使抗原结合片段与信号受体片段结合）；降解子稳定化（配体结合蛋白降解子以阻止 CAR 降解）；蛋白水解调控（蛋白酶抑制剂阻断 CAR 的破坏性蛋白水解切割）；转录调控（配体结合转录激活因子，指导其 DNA 结合或核定位）；重组酶调控（配体结合工程化 DNA 重组酶，使其定位于细胞核，翻转 CAR 基因以启动其表达）。b，CAR T 细胞 “关闭” 开关的原理及系统设计。小分子药物可降低功能性 CAR 水平，并能调控其表达量。该系统遵循 “[抗原] 与 非 [小分子]” 的布尔逻辑传导信号。系统设计包括：降解调控（蛋白水解靶向嵌合体（PROTAC）或分子胶结合 CAR 上的特定蛋白结构域，招募 E3 泛素连接酶启动 CAR 降解）；蛋白水解调控（蛋白酶抑制剂阻断 CAR 上降解子结构域的蛋白水解切割，导致 CAR 降解）；蛋白 - 蛋白相互作用（PPI）破坏剂（阻断含 CAR 信号结构域的蛋白片段与含抗原结合结构域的受体片段结合）；重组酶调控（配体结合工程化 DNA 重组酶，使其定位于细胞核，切除 CAR 基因以关闭其表达）。CAR，嵌合抗原受体；mRNA，信使 RNA；PPI，蛋白 - 蛋白相互作用；PROTAC，蛋白水解靶向嵌合体。

CAR蛋白降解的直接诱导

    通过小分子调控CAR蛋白降解，是调控CAR活性的一种高效、快速手段。多种CAR“关闭”开关和“开启”开关设计均采用了这一机制。其中一种设计利用已获FDA批准的分子胶来那度胺（及其类似物泊马度胺），由两个独立研究团队开发。来那度胺是沙利度胺类似物，属于含酰亚胺结构的免疫调节药物，它作为一种“分子胶”，可结合cereblon E3泛素连接酶，并将其靶向至IKAROS锌指蛋白，导致IKAROS降解。在这两种CAR设计中，IKAROS家族锌指蛋白3（IKZF3）的靶结构域均与CAR的C端融合。分子胶与该结构域结合后，会导致CAR融合蛋白发生多聚泛素化并降解。两种系统均表现出剂量依赖性降解，且CAR活性的动态范围较广。其中一种设计通过筛选先前发现的与沙利度胺类似物结合的锌指结合剂，开发出“超级降解子”变体，优化了初始构建体降解效率有限的问题；在动物模型中，优化后的系统显示出更高的亚纳摩尔级敏感性，且可在体内调控CAR的表达和功能。来那度胺已获FDA批准且有口服制剂，因此这类系统非常适合临床转化。

    一种相关策略利用PROTACs介导CAR降解。PROTACs是双功能小分子，由靶蛋白配体、连接子和E3泛素连接酶结合部分（最常见的是cereblon或von Hippel–Lindau）构成。与分子胶类似，PROTACs与靶蛋白和E3连接酶结合后，会导致靶蛋白泛素化并降解。用于CAR T调控的PROTAC-靶蛋白对包括ARV-771和ARV-825（靶向与CAR融合的溴结构域蛋白4（BRD4））。给予这些药物后，CAR T细胞的效应功能几乎完全且呈剂量依赖性降低。然而，观察到一定毒性，这可能是由于内源性BRD4降解所致，该毒性可能限制该系统的临床应用潜力。

    为实现正交调控，另一项设计采用了源自细菌酶——大肠杆菌二氢叶酸还原酶（eDHFR）的蛋白标签。该蛋白可特异性结合氨基嘧啶类抗生素甲氧苄啶（TMP）及其衍生物。PROTAC类分子甲氧苄啶-泊马度胺7c（TMP-POM-7c）可快速下调CAR表达（4小时内降低80%）。在体外实验和临床前小鼠模型中，该系统均有效。尽管未观察到毒性，但由于eDHFR源自细菌，其免疫原性可能成为临床转化的顾虑；不过初步分析显示，在免疫原性检测中其反应性较低。此外，研究人员还制备了18F放射性标记的TMP，可通过PET或CT成像在小鼠体内追踪CAR T细胞，并表征其生物分布。

降解子（degron）稳定化

    另一种CAR调控策略依赖药物稳定的蛋白降解子（degron）。在这种“开启”开关设计中，不稳定的蛋白降解子与CAR融合，导致CAR降解；只有当给予小分子配体结合降解子后，CAR蛋白才会被稳定。在一项设计中，CAR与FKBP12F36V.L106P结构域融合；加入FK506大环天然产物类似物Shield-1后，可在体外对CAR的水平和功能进行调控。另一项研究开发了基于eDHFR降解子的系统，以TMP为药物诱导剂，并在体内进行了测试；在小鼠模型中，该系统可有效减轻CAR T细胞诱导的全身性炎症。此外，该构建体还被用于验证“静息”CAR T细胞以改善其功能的概念：在未给予诱导剂的时间段内，T细胞存活时间延长，细胞耗竭减少，且CAR T细胞更接近记忆细胞表型，抗肿瘤活性显著提升。

    有趣的是，一种名为CAR-LID（配体诱导降解）的“关闭”开关系统，将Shield-1用于反向调控：Shield-1结合后，会使FKBP12F36V突变结构域中的隐性降解子暴露，从而诱导CAR降解。该策略在体外实验和小鼠模型中均显示出强效活性，但局限性在于Shield-1未获FDA批准。

蛋白水解调控

    另一种创新性CAR调控设计利用病毒蛋白酶和小分子抑制剂构建开关。“开启”开关的总体设计思路是：同时表达蛋白酶和含蛋白水解切割位点的CAR，蛋白酶可切割CAR使其失活；给予蛋白酶抑制剂后，切割被阻断，CAR得以保留。研究人员基于该思路开发了两种系统——VIPER-CAR和SNIP-CAR，均使用丙型肝炎病毒非结构蛋白3蛋白酶。尽管设计理念相似，但两种系统中蛋白酶的定位不同：VIPER-CAR中蛋白酶与CAR直接融合，而SNIP-CAR中蛋白酶作为独立的膜结合蛋白表达。这两种系统均由三种已获FDA批准的抑制剂调控：grazoprevir，danoprevir和asunaprevir。这些抑制剂均为含磺酰胺结构的肽模拟物，通过与蛋白酶活性位点非共价结合实现竞争性抑制。

    VIPER和SNIP-CAR均能强效调控CAR水平，且信号动态范围广。在体外实验和小鼠模型中，调整grazoprevir剂量可在降低毒性和细胞因子产生的同时，保留抗肿瘤活性。两种系统还具有一些独特特征：SNIP-CAR在抑制持续性激活和促进记忆T细胞形成方面效果尤为显著；VIPER系统则被拓展用于与来那度胺调控构建体结合，形成双系统，可通过正交小分子调控靶向两种不同抗原的CAR。

    在另一项研究中，研究人员开发了一种“关闭”开关系统——SWIFF-CAR。该系统中，CAR同时与蛋白酶和蛋白降解子融合；在基础状态下，有活性的蛋白酶切割降解子结构域，使CAR稳定表达；给予asunaprevir后，蛋白酶活性被抑制，降解子保留，导致CAR降解。这类系统具有多项适合转化的特征，包括口服药物制剂以及明确的药代动力学和药效学特征；唯一的局限性是病毒来源蛋白酶可能具有免疫原性。

CAR组装的调控

    将CAR蛋白拆分，利用CID使CAR片段重新组装，是另一种“开启”开关策略。最常见的设计是将CAR分为抗原结合结构域和信号结构域两部分，每个CAR片段均与CID结合结构域融合。已有多项研究报道了基于CID的系统，可对CAR T细胞激活进行滴定调控。其中一种名为“拆分CAR”的策略，将CAR分为两个不同的膜结合肽段，并分别与FRBT20891和FKBP12结构域融合；雷帕霉素类似物AP21967可诱导二者发生异源二聚化。另一种拆分CAR系统使用DID1和GAI结构域， diterpenoid植物激素赤霉素可诱导其发生二聚化。在体外实验中，这些系统可实现细胞因子产生和细胞增殖的滴定调控，效果与传统CAR T细胞相当；其中基于雷帕霉素类似物的设计在小鼠模型中还显示出体内功能。雷帕霉素类似物系统的可调控性以及使用人源组件的特点，使其在临床转化中具有优势。潜在局限性包括CID半衰期短、需重复给药以维持CAR活性，以及需静脉给药。

    一种相关设计——二聚化剂调控免疫受体复合物（DARIC），将CID相互作用结构域置于细胞外。这种定位使CID在极低浓度下即可诱导二聚化，进而激活CAR。该系统在雷帕霉素和AP21967浓度低至100 pM时仍可发挥功能；重要的是，考虑到该系统的免疫刺激作用，这些浓度远低于药物产生免疫抑制活性所需的剂量。在人肿瘤异种移植模型中的测试表明，该系统的CAR活性强效，且对CID的暂停给药和重新给药具有高度响应性。

    另一种名为“AvidCAR”的策略，利用AP21967使抗原结合亲和力低的CAR发生二聚化，通过提高亲和力触发信号传导。还有一种名为“多链CAR”的设计，基于IgE高亲和力Fc受体（FcεR1）的寡聚结构；该系统在低剂量下即可实现CAR T效应功能的滴定调控，半数有效浓度（EC50）为12 nM。

    在另一项巧妙设计中，研究人员将前文提及的基于来那度胺降解子的“关闭”开关，改造为“开启”开关组装系统：将来那度胺用作与CAR片段融合的结合蛋白（IKZF3和CRBN）的CID。该策略的关键在于突变细胞内可能作为泛素结合位点导致降解的赖氨酸残基。这类设计使用人源蛋白组件和已获FDA批准的口服小分子药物（雷帕霉素和来那度胺），非常适合临床转化。

    与CID介导的组装相对应，蛋白-蛋白相互作用（PPI）破坏剂被用于通过CAR解聚构建“关闭”开关。尽管PPI长期以来难以用小分子靶向，但近年来通过计算药物设计的进展，已开发出多种处于研究阶段的PPI破坏剂。在“STOP-CAR”系统中，研究人员通过计算设计构建了可被化学破坏的异源二聚化蛋白。他们选择靶向B细胞淋巴瘤超大蛋白（Bcl-XL），原因是已知抑制剂A-1155463和A-1331852具有长半衰期、高亲和力且在人体中耐受性良好。这些化合物是强效、特异性的BH3模拟抑制剂，可结合Bcl-XL的疏水凹槽。尽管Bcl-XL是适合与CAR融合的球状结构域，但其相互作用蛋白Bcl-2相互作用介质（BIM）为非结构化蛋白。研究人员通过计算设计，构建了一种植入BIM结合基序的人源球状蛋白支架（命名为LD3）。将LD3和Bcl-XL结构域分别与CAR片段融合后，Bcl-XL与LD3的相互作用可驱动CAR组装。STOP-CAR T细胞的效应功能与标准CAR T细胞相当；在A-1155463浓度低至10 nM时，即可观察到CAR活性的剂量依赖性下调；洗脱药物48小时后，活性可恢复。

    研究人员还利用四环素阻遏蛋白B类（TetRB）开发了一种相关系统，已知TetRB可结合短肽TIP；四环素类似物米诺环素可用于破坏CAR活性。米诺环素是已获FDA批准的通用抗生素，具有口服生物利用度；但源自细菌的TetRB蛋白可能具有免疫原性。为解决这一问题，研究人员基于结合米诺环素的单域抗体，开发了另一种PPI系统：通过筛选肽库，鉴定出可被米诺环素置换的抗体结合肽，并利用这些结合肽构建了“关闭”开关CAR（MinoCAR）及多种基因调控系统。

    最后，研究人员以VIPER系统为基础，开发了第四种破坏剂系统：将NS3蛋白酶突变，使其能结合靶肽但无法切割，将其作为一种结合剂，靶肽作为另一种结合剂；给予格佐普韦后，可成功破坏二者相互作用，从而调控CAR活性。总体而言，STOP-CAR和MinoCAR系统采用人源组件，且具有良好的药代动力学特征，这使其在转化应用中具有优势。

转录调控

    另一重要策略是通过小分子调控CAR的转录。哺乳动物细胞的转录基因调控系统早在30多年前就已开发，如今已成为细胞培养和动物模型研究中的常用工具。这类系统可实现严格的基因调控，且动态范围广，因为它们可在蛋白质产生前在mRNA水平限制基因表达。然而，该系统也存在局限性：基因调控的动力学相较于直接调控蛋白质功能更慢；此外，诱导型基因启动子可能易受沉默影响，从而限制其激活潜力。

    首个应用于CAR T细胞的转录诱导系统，基于早期研究工具中使用的转录因子。其中一种系统利用源自细菌的四环素转录阻遏蛋白（TetR）和反向转录激活因子（rTTA），由四环素类似物多西环素调控。多西环素结合rTTA后，rTTA发生构象变化，使其能够结合启动子区域，激活CAR表达。利用TetR系统，CAR水平可实现严格调控，诱导倍数达20倍；且只有在药物和抗原同时存在时，CAR T才会激活。然而，该系统的转导效率较低（约15%），这可能是由于基因沉默所致。后续一种变体通过双病毒系统，将转导效率提升至约30%。

    另一种系统利用基于雌激素受体的转录因子，由选择性雌激素调节剂他莫昔芬及其活性代谢物4-羟基他莫昔芬（4-OHT）调控。该转录因子由合成锌指转录因子与雌激素结合结构域融合而成。4-OHT结合后，转录因子进入细胞核，结合DNA并激活CAR转录。在小鼠模型中，调整他莫昔芬剂量可精细调控抗肿瘤功能。

    在近期一项研究中，研究人员开发了名为“SynZiFTR”的药物诱导型锌指转录因子，可被格佐普韦或4-OHT-他莫昔芬激活。该研究中使用的DNA结合结构域可识别18个碱基对的DNA序列，因此激活非靶基因的可能性极低。格佐普韦调控的SynZiFTR含有NS3蛋白酶，该蛋白酶会发生自切割并破坏转录因子，除非被小分子抑制；与先前研究类似，4-OHT-他莫昔芬系统通过核定位发挥作用。在体外实验和人肿瘤小鼠模型中，这些转录因子均表现出强效的小分子特异性活性。研究人员还利用该系统共表达另一种转基因——超级IL-2，该因子可促进CAR T细胞扩增及其抗肿瘤活性。TetR和NS3系统的免疫原性仍是转化应用中的顾虑；尽管他莫昔芬诱导系统可能具有优势，但需持续给药可能导致不良毒性。

重组酶调控

    “记忆开关”是一种无需小分子诱导剂持续存在的替代设计：给予单次小分子剂量后，即可维持或关闭CAR表达。这类系统基于在小鼠遗传学研究中发挥关键作用的药物诱导型重组酶。其中一种名为“翻转-切除”（FLEx）的设计，使用ERT2-FLPO重组酶融合蛋白，该蛋白与4-OHT结合后会进入细胞核；重组酶可使CAR基因翻转，从而开启或关闭其表达。尽管在4-OHT诱导前该系统存在一定泄漏，但暴露于4-OHT 24小时后，高达75%的细胞中CAR被强效且可滴定地诱导表达；令人振奋的是，在初始4-OHT诱导后15天，CAR表达仍可维持。该系统具有适合转化的特征，包括使用已获FDA批准的诱导剂以及单次给药即可发挥功能；但源自细菌的重组酶可能具有免疫原性，这是其局限性。

    最后，另一种“关闭”开关策略是使用已获FDA批准的酪氨酸激酶抑制剂达沙替尼。尽管达沙替尼并非CAR T细胞特异性药物，但它可抑制CAR的磷酸化，用于使细胞“静息”并调控活性。达沙替尼的缺点是可能调控内源性细胞的激酶信号通路，但其优势在于无需对CAR进行额外工程改造即可发挥作用；目前该策略正处于临床试验阶段。

抗原靶向

    为开发可靶向多种抗原的CAR T细胞，多个研究团队