文章来源公众号：曲别针在学医 作者：曲别针
目前几个成熟的FDA批准上市的CAR-T细胞治疗，都属于ex vivo的离体CAR。从自体CAR到通用型CAR再到in vivo CAR-T，我们都经历了什么呢？
一、CAR-T的工程化进展历程
Ex vivo同种CAR-T（自体CAR-T）
时间：1989年至2017年（首个产品获批）
技术流程：
①白细胞分离术收集T；
②体外慢病毒or逆转录病毒转染CAR基因；
③扩增CAR-T；
④清除淋巴细胞并回输。
这是最经典的CAR-T细胞疗法。它的疗效也摆在那儿，对血液肿瘤有80%左右的CR率，但对实体瘤的CR率就很低了。
它的缺点在于“贵、慢、难”。
自体CAR-T需要个性化定制，制备周期约3~4周；患者经济负担重，成本需要30~50万美元/剂；婴幼儿、老年人or经历过化疗的人，他们的T活性不好，扩增困难。
在2012年，随着CRISPR/Cas9的发表，基因编辑变得既方便又便宜，通用型CAR-T便提上日程。
Ex vivo异体CAR-T（通用型CAR-T）
时间：2015年至今（仍在研究/早期临床）
技术流程：
①采集健康供体（healthy donor）T细胞（异体）；
②体外慢病毒or逆转录病毒转染CAR基因；
③敲除TCR、HLA I/HLA II类分子、CD52；
④扩增CAR-T；
⑤清除淋巴细胞并回输。
这种方法能够制备标准化的CAR-T，属于off the shelf的现货即用疗法。它缩短了制备周期，目标成本约5~10万美元/剂，用healthy donor的T可以筛选状态好的T。把上述三个“贵、慢、难”的问题都解决了。
但这样的方法也有缺点。
这个方法需要敲除TCR和HLA，避免GvHD和HvG。而敲除TCR的T细胞在体内存活不了多久就死了，持续性差；这个方法仍然需要化疗清淋；工厂冷链也同样不可或缺。
2019年，新冠疫情爆发，LNP-mRNA技术在新冠疫苗中被验证是有效的。人们开始思考：能不能连体外制备CAR-T的工厂也不要了呢？
In vivo CAR-T
时间：2020s至今（仍在实验阶段）
技术流程：
①静脉注射携带CAR基因的纳米载体或病毒载体；
②靶向体内T细胞并实现基因整合和表达。
In vivo CAR希望把CAR-T变成一瓶药。用药之后，CAR基因就能整合进体内，从而解决上述所有的问题。在这样的背景下，新问题出现了。
用什么载体递送CAR基因？
目前有很多种递送CAR的载体，包括LNP、慢病毒等。每个递送平台都有它独特的优点和缺点。
一个合格的载体，至少需要具备以下特征：
①靶细胞只有T；
②高转导效率，且携带共刺激信号；
③逃避免疫系统的监视；
④携带可控安全开关。
下面介绍几种主流载体及其优势劣势。
二、In vivo CAR-T的载体
LNP-mRNA
脂质纳米颗粒（LNP）是一种会被细胞内吞的物质。用LNP包埋mRNA后，细胞内吞LNP时，mRNA会逃逸进入细胞质，翻译后降解。
在LNP表面偶联一些T细胞表面的特异性配体，可以促进T细胞对LNP的摄取。
目前一些常见的配体包括：
①CD3 scFv/CD8 scFv，特异性靶向T细胞或细胞毒性T细胞；
②趋化因子配体：CCL21，可结合T表面CCR7受体，靶向淋巴结归巢T细胞；
③Aptamer：针对CD28的Aptamer不仅能够靶向T细胞，还能够提供共刺激信号从而激活T细胞。
慢病毒（LV）
LV是由HIV病毒改造而成的工程化病毒。我们在小学二年级的时候曾经学过，慢病毒通过VSV-G与低密度脂蛋白受体LDL-R结合，实现基因的转染。
而LDL-R并不只在T细胞表面表达，而是广泛表达在许多细胞中。
因此，也需要设计靶向T细胞的一些特异性配体。有人选用CD3 scFv靶向所有T，有人选用CD8 scFv靶向细胞毒性T，也有人选用CD7 scFv靶向非激活状态的T。
与上面类似，这种方法也可以加入趋化因子配体和共刺激配体。
其他方法
各种方法都异曲同工。别的方法包括封装核酸的聚合物纳米颗粒（PBAE）、AAV、生物指导植入式支架、Cas9-EDV、病毒模拟融合纳米囊泡等。
主要需要对比的是这些方法的靶向性，转导效率及安全性。
三、对比LNP-mRNA和LV
目前看来，如果想要“快速、便宜、重复给药”，LNP-mRNA是一个不错的选择；如果想要“高T细胞靶向、一次给药长期表达”，可以选用LV。
结语
虽然In vivo CAR-T还在I期临床的起跑线，但门票已经一票难求。靶向、安全和成本三件事如果都能做到，即使是复制mRNA疫苗的爆发式增长曲线也能变成现实。
