文章来源公众号：细胞与基因漫谈 作者：小土豆豆
在CAR-T细胞疗法中，单链抗体（scFv）是CAR结构的核心组成部分，直接决定了CAR-T细胞对靶抗原的特异性、亲和力以及最终的治疗效果和安全性。筛选到一个好的scFv结构需要综合考虑多个因素，包括抗原结合特性、稳定性、免疫原性、表达效率等。
(CAR基本结构示意图，图片来自网络）
对scFv的选择可以有以下过程和考量因素。
1. 靶点选择与抗原表位分析
(1) 靶点选择
肿瘤特异性高：理想靶点应在肿瘤细胞高表达，而在正常组织低表达或无表达（如CD19在B细胞恶性肿瘤中）。
非分泌型抗原：避免靶向可溶性抗原（如某些细胞因子受体），否则CAR-T可能被“中和”而失效。
临床验证靶点：优先选择已有CAR-T成功案例的靶点（如BCMA、CD22），但这样可能会出现靶点同质化。
(2) 抗原表位分析
膜近端表位（靠近细胞膜）：可能增强CAR-T活化（如CD19的膜远端表位易被蛋白酶切割，影响持久性）并能够更加稳定饿CAR信号传导。
构象表位 vs 线性表位：scFv需识别天然构象（可通过流式细胞术验证）。
2. scFv来源与筛选方法
(1) scFv来源
来源 | 优点 | 缺点 |
鼠源单抗 | 易获得（比如杂交瘤技术） | 高免疫原性 |
人源化/全人源抗体 | 低免疫原性，适合临床 | 开发周期长，成本高 |
噬菌体展示库 | 高通量筛选，可获高亲和力scFv | 后续需要优化稳定性 |
羊驼抗体 | 体积小，稳定性高，易穿透实体瘤 | 可能需要人源化 |
(2) 筛选技术
噬菌体展示：从大型抗体库（如人类天然库）中筛选高亲和力scFv。通过抗原固相包被或细胞表面展示进行淘选。
酵母展示：可同时评估表达水平和亲和力（流式分选）。
单B细胞测序：从免疫动物或康复患者中直接克隆scFv基因。
3. scFv的优化关键参数
(1) 亲和力
适中亲和力（KD~1-10 nM）：过高亲和力（KD<1 nM）可能导致肿瘤细胞未被杀伤但CAR-T细胞已耗竭。过低亲和力（KD>100 nM）则无法有效激活CAR-T细胞。
(2) 特异性
交叉反应测试：排除与非靶抗原的结合（如正常组织蛋白组芯片筛查）。
脱靶毒性评估：如使用原代细胞共培养或人源化小鼠模型。
(3) 稳定性
热稳定性：差示扫描量热法（DSC）检测Tm值（>60°C为佳）。
聚合倾向：尺寸排阻色谱（SEC）检测单体比例（>90%）。
表达效率：在HEK293或T细胞中验证scFv-CAR的表达水平（流式/Western blot）。
(4) 免疫原性
若scFv的免疫原性较高，患者免疫系统可能产生抗药抗体（ADA），中和CAR-T细胞或加速其清除，导致CAR-T细胞的持久性下降。此外，scFv较高的免疫原性可能激活宿主B细胞/T细胞，释放更多促炎因子，增加引发细胞因子风暴的可能。
4. scFv功能验证
(1) 体外实验
抗原结合能力：流式细胞术检测scFv与靶细胞结合。
CAR-T细胞活化：检测激活标志物（CD69、CD25）及细胞因子分泌（IFN-γ、IL-2）。
杀伤效果：实时细胞分析（如xCELLigence）或细胞杀伤实验。
(2) 体内实验
小鼠肿瘤模型：免疫缺陷小鼠（NSG）接种人源肿瘤，评估CAR-T细胞的浸润和清除效果并监测毒性反应。
因此，在设计CAR的scFv结构或序列时，可以从靶点验证→scFv来源选择→高通量筛选→亲和力/特异性优化→稳定性测试→功能验证→临床前评估等的过程来进行选择，最终获取到高特异性、适中亲和力、低免疫原性、高稳定性的scFv，以构建安全有效的CAR-T细胞。
