CAR-T细胞疗法在血液系统恶性肿瘤治疗中取得了突破性进展，特别是在B细胞白血病和淋巴瘤的治疗中展现出令人瞩目的临床效果。然而，这一疗法在实体瘤治疗领域却屡屡受挫，面临着多重生物学屏障的严峻挑战。首先，实体瘤特有的免疫抑制微环境会显著削弱CAR-T细胞的活性，表现为免疫检查点分子（如PD-1、CTLA-4）的过度表达和抑制性细胞因子（如TGF-β、IL-10）的富集。其次，实体瘤普遍存在的抗原异质性导致靶抗原丢失或下调，使得CAR-T细胞难以持续识别和清除肿瘤细胞。此外，物理屏障（如致密基质）和化学屏障（如缺氧、低pH）也严重限制了CAR-T细胞的浸润和存活。为突破这些限制，研究人员开发了“装甲型”CAR-T细胞，通过基因工程手段使其分泌免疫调节因子来重塑肿瘤微环境。IL-12因其强大的免疫激活能力成为首选，它能促进T细胞和NK细胞的活化，增强抗原提呈，并抑制调节性T细胞（Treg）的功能。然而，IL-12的全身性表达会引发严重的剂量限制性毒性，包括多器官炎症反应和致命的细胞因子风暴。这一安全性问题在早期临床试验（NCT01236573）中尤为突出，导致研究被迫终止。因此，开发能够精确控制细胞因子表达时空特异性的技术平台，成为推动装甲型CAR-T临床转化的关键突破口。近日，澳大利亚彼得﹒麦卡勒姆癌症中心Paul A. Beavis、Phillip K. Darcy、Amanda X. Y. Chen和Kah Min Yap联合在Nature期刊上发表了文章Rewiring endogenous genes in CAR T cells for tumour-restricted payload delivery，本研究开发了一种创新的CRISPR基因编辑策略，通过将治疗性细胞因子（如IL-12）精准插入CAR-T细胞的内源性基因（NR4A2/RGS16）位点，利用这些基因的肿瘤微环境特异性启动子实现细胞因子的精准定位表达，在显著增强抗肿瘤疗效的同时避免了全身毒性，为实体瘤的CAR-T治疗提供了突破性解决方案。本研究创新性地提出了“内源性基因重编程”策略，通过整合系统生物学分析和基因编辑技术，实现了CAR-T细胞功能的全新优化。作者首先采用多组学方法，通过对肿瘤浸润CAR-T细胞和脾脏CAR-T细胞的转录组测序（RNA-seq）进行系统性比较，绘制了肿瘤微环境特异性基因表达谱。借助生物信息学分析，从数千个差异表达基因中筛选出27个候选基因，这些基因在肿瘤组织中呈现显著高表达，而在外周组织中保持静默状态。其中，核受体NR4A2和G蛋白信号调节因子RGS16因其突出的肿瘤特异性表达模式脱颖而出。在技术层面，作者开发了一套高效的CRISPR-Cas9介导的同源定向修复系统。针对每个候选基因，设计包含同源臂的修复模板，将报告基因（GFP）或治疗性细胞因子基因（如IL12、IL2）精准插入目标基因的翻译起始位点下游。通过系统的实验验证，研究证实NR4A2和RGS16启动子驱动的转基因表达具有显著的肿瘤组织特异性。研究表明，在多种实体瘤模型中，NR4A2/GFP CAR-T细胞在肿瘤部位的GFP阳性率高达80%，而在脾脏、肝脏等外周组织中阳性率不足2%，显著优于传统NFAT启动子系统（外周泄漏表达达10%）。这种严格的表达调控使得IL-12的局部递送成为可能：在MC38结肠癌模型中，NR4A2/IL-12 CAR-T细胞不仅完全清除了已建立的肿瘤，还诱导了持久的免疫记忆，并且这些疗效的取得完全没有伴随传统IL-12疗法常见的毒性反应，治疗组小鼠的体重、血清细胞因子水平和组织病理学检查均与对照组无显著差异。单细胞RNA测序分析揭示了NR4A2/IL-12 CAR-T细胞的独特活化特征。这些细胞表现出显著的代谢重编程和效应分子的高表达。此外，它们能够重塑肿瘤免疫微环境：通过上调MHC分子增强肿瘤抗原提呈，促进树突状细胞成熟，并招募内源性CD8+ T细胞参与抗肿瘤反应。TCR测序证实，治疗后肿瘤内出现了显著的新抗原特异性T细胞克隆扩增，表明成功诱导了表位扩散效应。其次，作者成功将该技术应用于患者来源的CAR-T细胞。来自弥漫大B细胞淋巴瘤患者的T细胞经过NR4A2/IL-12编辑后，在体外展现出与健康供体细胞相当的扩增能力和肿瘤杀伤活性。重要的是，在低抗原密度（模拟临床常见的抗原逃逸情况）条件下，这些细胞仍能维持有效的细胞因子分泌和肿瘤控制能力。作者还开发了“一步法”生产流程，通过单次电转同时实现TRAC位点的CAR基因插入和NR4A2位点的细胞因子基因整合，大大简化了临床级CAR-T细胞的制备工艺。综上所述，本研究开发了一种基于CRISPR的基因敲入策略，通过利用内源基因的调控机制实现转基因的肿瘤局部特异性表达。通过筛选具有肿瘤限制性表达特征的内源基因，发现NR4A2和RGS16启动子能有效驱动IL-12和IL-2等细胞因子在肿瘤部位的靶向递送，在同源移植和异种移植小鼠模型中均显著增强抗肿瘤效果并提高长期生存率。该效应伴随着CAR-T细胞多功能性的提升、内源性抗肿瘤免疫的激活以及良好的安全性特征，并且在患者来源的CAR-T细胞中同样适用。
