来源：普鲁卡因Procaine
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实验概述
细胞培养(Cell culture)是在体外模拟体内温度、酸碱度、营养条件等环境，使之生存、生长、繁殖并维持主要结构和功能的一种方法，细胞培养也叫细胞克隆技术。
细胞培养是细胞和分子生物学中使用的主要工具之一，为细胞正常生理学和生物化学研究(例如代谢研究、衰老)、药物和毒性化合物对细胞的作用以及致突变性和致癌性研究提供了出色的模型系统。细胞培养还可用于药物筛选和开发，以及生物化合物(例如疫苗、治疗性蛋白质)的大规模生产。
对于细胞培养，许多初学者在独立操作过程中难免遇到诸多疑问和挑战，诸如细胞污染，细胞漂浮，细胞增殖停滞，细胞形态发生变化，细胞死亡等。本文以贴壁细胞为例，希望初学者们能对细胞培养体系有一宏观认识，对具体操作也能轻车熟路。
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细胞类型
根据细胞的生长方式可分为三种类型：
(1) 贴壁细胞：指在培养基表面附着生长的细胞。这类细胞在培养皿内沿着培养基表面贴壁生长，正常细胞形态较好，轮廓清晰，边缘透亮，细胞增殖状况良好。当贴壁细胞生长到密度达到 90% 时，需要进行传代以维持其正常生长状态。
(2) 悬浮细胞：指在培养基中悬浮生长的细胞，不依附于培养皿表面。这类细胞在培养基中均匀分散生长，通常需要使用适当的搅拌或旋转设备来保持细胞的悬浮状态。悬浮细胞适合用于大规模培养和生产。
(3) 半贴壁半悬浮细胞：指在培养基中部分附着生长，部分悬浮生长的细胞。这类细胞同时具备贴壁细胞和悬浮细胞的特点，通常在培养基中部分附着生长，部分悬浮于培养基上。对于此类细胞的培养需要综合考虑贴壁和悬浮培养的条件来进行。
根据细胞的来源不同可分为三种类型：
(1) 原代细胞(Primary cell)：直接从体内取出的细胞、器官或者组织分离出的第一代细胞。更接近于细胞的在体状态和特性，但获取及培养均较难。一般认为，将第1~10代培养细胞统称为原代培养细胞。在人工条件下，原代细胞被培养和传代，用于研究细胞的生命周期、细胞癌变、细胞工程等问题。
(2) 细胞系(Cell line)：是由原代培养物经首次传代成功后，在体外培养条件下不断分裂和繁殖而形成的细胞群。
特征：① 细胞系通常来自于原代细胞培养物、单个原始组织或细胞的特定个体。该单个细胞通过分裂和传代培养，不断产生相同类型的细胞，形成一个可持续的细胞系。② 细胞系可理解为可连续传代的细胞，其中能够连续传代的细胞叫做连续细胞系或无限细胞系(可培养50代以上)，不能连续培养的称为有限细胞系。③ 细胞系常用于探究细胞的生物学特性、疾病机制以及药物开发等，在基础生物学研究、药物筛选等领域广泛应用。
(3) 细胞株(Cell strain)：是通过选择法、克隆形成法或其他方法从原代培养物或细胞系中获得具有特殊性质或标志物的培养物。大部分情况下为细胞系的某一特定分支或亚群，细胞株可培养40~50代。
特征：① 细胞株是原代细胞或细胞系的一个分支，通过特定的处理或分选过程从原始细胞或细胞系中分离而来。② 细胞株可能具有特定的生物学特性或标志，且该特征或标志必须在整个培养期间始终存在。③ 细胞株常用于特定的研究任务或生产工艺中，例如，某些细胞株可能更适合生产蛋白质、疫苗或其他生物制品。
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培养条件
细胞培养实验室必须严格控制环境条件，包括温度、湿度和气体成分。此外，无菌操作是细胞培养成功的关键，所有操作均在超净工作台内进行，以避免微生物污染。
(1) 营养需求
氨基酸：12种必须氨基酸(缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、赖氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、组氨酸、酪氨酸、精氨酸、半胱氨酸)；10种非必须氨基酸；此外还需要谷氨酰胺，它在细胞代谢过程中有重要作用，所含的氮是核酸中嘌呤和嘧啶合成的来源，同样也是合成三、二、一磷酸酰苷所需要的基本物质。
碳水化合物：糖类--葡萄糖；半乳糖；细胞对葡萄糖的吸收能力最高，半乳糖最低。
无机盐：钠、钾、镁、磷、钙等；
维生素：生物素、叶酸、核黄素、维生素C、维生素B12、吡哆醇等；
蛋白质与肽：白蛋白、抑肽酶、胎球蛋白、纤粘连蛋白、转铁蛋白、生长因子；
脂肪酸和脂类物质：亚油酸、油酸、胆固醇等；
微量元素：铁、锌、硒、铜、锰、钼、钒等。
(2) 温度
最常用的温度是 37°，但需要注意不同生物来源的组织细胞，最适宜的培养温度是不同的，且细胞耐低温，不耐高温。在生理温度范围内，温度与细胞生长率呈正相关。
(3) 渗透压
渗透压的大小主要由培养基中各种盐成分的浓度决定。细胞必须生活在与自身原生质体等渗的环境中，若生存环境渗透压高于自身，培养的细胞则有可能会面对脱水而亡，若生存环境渗透压低于自身，培养的细胞则有可能面对吸水涨破而亡，但大多数培养细胞对渗透压有一定耐受性。人血浆渗透压 290 mOsm/kg , 可视为培养人体细胞的理想渗透压。鼠细胞渗透压在 320 mOsm/kg 左右。对于培养大多数哺乳动物细胞，控制培养基的渗透压在 260-320 mOsm/kg 的范围为宜。
(4) 气相
体外细胞培养的气相环境常由 5% CO2 与 95% 空气构成。其中 O2 参与细胞的能量代谢过程。CO2 用于维持培养液的酸碱度。
(5) pH
适宜大多数细胞生长的培养基 pH 在 7.0-7.4 之间，pH 7.4 的环境适合大多数的哺乳动物细胞系。酚红在培养基中被用来作为 pH 值的指示剂，用以持续监测培养液的酸碱度，在低 pH 值时酚红使培养液呈黄色，而较高的 pH 值时使培养液呈紫色，pH 值 7.2-7.4 时为红色，最适合细胞培养。
(6) 无毒无污染
无毒和无菌是体外培养细胞的前提条件。在活体的细胞的解毒系统和免疫系统，可抵抗微生物或其他有害物质的入侵，但细胞在体外培养中，缺乏机体免疫系统的保护从而丧失对微生物的防御能力和对有害物质的解毒能力。因此保证细胞的生长环境的无毒无污染是细胞培养成功的首要条件。在细胞培养过程一定要注意防止有毒化学物质污染、微生物污染、不同细胞间交叉污染。
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细胞培养基
培养基既是供给细胞营养和促使细胞增殖的基础物质，也是细胞生长和增殖的环境，所以非常重要。细胞培养液是建立在平衡盐溶液(BSS)基础上，添加了碳水化合物、氨基酸、脂类、无机盐、维生素、微量无素和细胞生长因子等。常见细胞培养基可分为基础培养基、完全培养基和无血清细胞培养基三类。
基础培养基主要是指未添加血清的合成培养基以及一些专为特定原代细胞设计的专用基础培养基。
完全培养基是指在基础培养基的基础上添加了血清的培养基，可能还含有一些特殊的细胞生长因子、抗生素（如双抗）等。
无血清培养基是指通过添加已知成分的组分（如转铁蛋白、白蛋白、胰岛素等）替代血清，用于特定细胞培养的培养基。
提到常用的培养基，其实就四种: MEM、DMEM、1640、F-12。一般的细胞系用 1640、DMEM 均可，90% 以上的细胞都可以养的很好，包括原代肿瘤细胞。需要特殊培养基的细胞，在文献里一般都会注明的，大家照着文献选用即可。下面，分别介绍一下它们各自的成分和特点。
(1) MEM 是应用最广泛的细胞培养液，其中含有13 种必须氨基酸、8 种维生素、以及多种微量元素。能力非常全面的，优点非常突出。
(2) DMEM 是在 MEM 的基础上发展而来的，double了原来各成分的含量。分高糖型(含葡萄糖 4500 mg/L)和低糖型(含葡萄糖 1000 mg/L)两种，高糖型适用于生长较快，附着性较差的肿瘤细胞。低糖型对于生长速度较快、附着性差的肿瘤细胞有利。
(3) 1640 简单朴素，营养成分比较简单，比 DMEM 少一点糖和谷胱甘肽。
(4) F12 也包括非必须氨基酸，维生素的范围亦很广，另外常规含有无机盐和代谢添加剂(例如核苷酸)。但是，F12 中含有硫酸亚铁，据报道有神经毒效应。对于很多神经细胞是有毒性作用的。
注意事项
细胞培养基配好后，要先抽取少许放入培养瓶内在 37 ℃培养箱内放置 24~48 h，检测培养液是否有污染，然后方可用于实验。配置培养基所需的血清要合格并且保持稳定。一个批号试用效果良好后，就可一次购入较多同一批号的血清，这样实验条件稳定，配液时调整 pH 值较容易。每次配液量以使用两周左右的量为宜，一次配液不要太多，一是短期内用不完造成营养成分损失需要补充，二是量大易造成污染。
为何培养基保存于 4 ℃ 冰箱中，颜色会偏紫色?
培养基保存于 4 ℃ 冰箱中，培养基内的 CO2 会逐渐溢出，造成培养基越来越偏碱性，而培养基中的酸碱指示剂 酚红的颜色也会随碱性增加而更偏紫色。培养基偏碱的结果， 将造成细胞生长停滞或死亡。若培养基偏碱时，可以通入无菌过滤 CO2，以调整 pH 值。
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培养原则
(1) 无菌原则：
① 操作台环境无菌：在实验操作前，必须对操作台进行紫外线消毒至少 30 分钟，然后用 75% 酒精擦拭，确保操作台表面无菌。
② 实验材料无菌：对实验所需材料进行无菌处理，包括紫外线照射、酒精擦拭、使用酒精灯进行消毒，以及使用封口膜保持材料的无菌状态。
③ 实验时手部无菌：进行实验操作前，必须对双手进行消毒，确保双手无菌状态，避免细菌感染。
④ 实验操作无菌：在实验操作过程中，必须保持操作环境和操作方式无菌，避免细胞培养过程中受到外界细菌的污染。
(2) 减少细胞环境扰动原则：
① 保持培养箱内温度恒定：在进行细胞培养操作前，要确保培养箱内温度稳定，同时对培养基进行预热，以保持细胞在适宜的环境中生长。
② 转移细胞时轻拿轻放：在进行细胞转移操作时，要轻柔地操作，避免造成细胞的震动和损伤。
③ 控制细胞在培养箱外的时间：尽量缩短细胞在培养箱外的时间，以维持 CO2 浓度的稳定，确保细胞在最适宜的环境中生长。
④ 枪头吹打要轻柔：在使用枪头吹打时要注意轻柔操作，避免对细胞造成破坏，保证细胞的健康生长。
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常见实验步骤
细胞鉴定
我们之所以选定某种细胞系开展实验，是因为所选细胞系的一些特性符合研究方向的设定。比如组织特性，疾病特性，功能特性，基因表达特性等。一旦用错了细胞株，对我们研究结果的判断就会带来很大的误差和不确定性。因此，做实验前对细胞株验明正身非常重要。如果是在机构购买的细胞株，最好能让供方提供合格的STR鉴定报告。目前，STR基因分型方法是进行细胞交叉污染和性质鉴定的最有效和准确的方法之一，是ATCC等权威机构认定的金标准。不过可惜的是并非所有细胞均可进行STR鉴定，目前只有大部分的人源细胞株和45个种类的小鼠细胞株可以进行鉴定。其他细胞株可以结合细胞形态、特性和物种鉴定来进行确认。
细胞复苏
1、将从 -80℃冰箱或液氮罐中取出的细胞，迅速拿到 37℃水浴锅中快速融化，融化完全后酒精消毒后移至操作台；
2、将含有细胞的冻存液转移到离心管中，并加入同等体积的培养基；
3、随后在1000 rpm/min，3 min条件下离心，弃去上清液（培养液+冻存液），留下沉淀（即为细胞）；
4、加入培养液将细胞沉淀轻轻重悬，混匀后加入培养瓶中，轻轻摇匀使细胞分布均匀，然后放入37℃恒温培养箱中，细胞复苏即完成。
细胞传代
从培养箱中拿出培养皿，在倒置显微镜下观察细胞状态（贴壁情况，细胞形态以及细胞吻合度等），通常细胞达到 80%-95% 密度时可以用于细胞传代操作。
1、首先用移液枪吸弃旧培养基，使用不含钙镁离子的平衡盐溶液（PBS）冲洗细胞。从与贴壁细胞层相对的容器一侧轻轻加入冲洗液，以避免搅动细胞层，前后摇晃容器数次，最后移弃冲洗液（洗去残留的血清，避免影响胰酶的活性）；
2、加入胰酶，以 25 cm2 的培养瓶为例，向瓶内加入300μL 胰蛋白酶-EDTA（请根据各细胞的指引使用合适的浓度）消化液，轻轻摇动培养瓶，使消化液流遍所有细胞表面，放到 37 ℃ 孵育。通常，几分钟内，会发现胞质回缩、细胞间隙增大，倾斜培养瓶时细胞层能自然流下，此时应加入 2-3mL 含血清的完全培养液终止消化（细胞解离所需时间请参考各细胞的指引，并建议每隔 30 秒在显微镜下观察细胞的解离情况）；
3、使培养瓶倾斜，吸取培养瓶内液体轻轻冲向原细胞生长表面，重复该动作 2-3 次，使所有细胞沿瓶底流下，再轻柔地把细胞吹打成单个悬液（吹打过程中应避免气泡的产生）；
