文章来源公众号：生物快评 作者：生物快评
慢病毒原理背景
HIV病毒颗粒和基因组
HIV病毒是属于envelope virus,这个envelope本意指的是信封上盖的蜡戳，用于封闭信件的作用，这里指的是病毒粒子外面有一层磷脂双分子脂质层。就是上图中的绿色部分，这样的有点是病毒的例子完全被双分子层的膜罩住了，那么暴露的抗原自然就少了。相对比non-envelope virus就需要病毒粒子直面宿主的免疫系统。
因为在水溶液中，人体的环境下，膜和膜融合不是天然发生的事情，需要克服膜周边水分子的排次作用，所以这样也给病毒和宿主细胞膜融合带来了另一个问题就是“感染入侵的问题”，这里需要进化出一套精密的“分子机器”，来完成病毒的膜和宿主细胞膜的融合。这些融合的完成需要依靠“配体-受体”作用来完成。
DOI:10.1016/j.bbamem.2016.02.007
病毒的蛋白质包括：
Gag: 这个gag是产生结构蛋白,gag这个名称怎么来的？一般在病毒学研究中，研究者对基因的命名充满了随意和简单直接，不像对人基因的命名要信达雅，这个鬼畜的缩写是group of antigen,意思是这个病毒蛋白主要激发人体产生抗体的，所以叫做“一组抗原”。
gag蛋白质产生MA/CA/NC。分别是MA: matrix蛋白，矩阵蛋白，结合包膜的作用，类似房屋的顶部支撑，。CA：capsid蛋白，包裹病毒粒子的作用，类似药物的胶囊壳。NC: nucleocapsid protein，NC是负责包裹病毒的核酸物质。最终通过
“俄罗斯套娃”一样的结构，得到封装好的HIV病毒粒子。
pol: pol蛋白是产生病毒的酶相关的蛋白：包括PR: 蛋白酶，RT：逆转录酶；IN: 整合酶（负责将DNA整合进入宿主基因组组）。
gp120和gp41，它们是一个复合体的两个部分，共同被称为包膜糖蛋白，是HIV病毒入侵人体细胞的“钥匙”，也是艾滋病药物和疫苗研究最重要的靶点之一。gp120：是暴露在外的“钩子”或“探头”，负责识别和初步结合目标细胞。gp41：是隐藏的“弹簧刀”或“锚”，负责膜融合，即刺穿细胞膜，让病毒核心进入细胞。
Rev：Rev is a transactivating protein that is essential to the regulation ofHIV-1 (and other lentiviral) protein expression。负责完整RNA从细胞核运输到细胞质中，完成病毒完整RNA和蛋白质的组装。
Tat: Trans-activator oftranscription（反式转录激活因子），大幅增强病毒基因的转录（将DNA模板转化为RNA的过程），没有Tat，HIV的复制效率会极低。
HIV的gp120/gp40包膜为VSV病毒的G蛋白
https://viralzone.expasy.org/5096
HIV病毒通过受体gp120结合受体CCR5、CD4之后，然后激动触发gp40暴露，gp40结构发生变化将gp40的疏水端插入到细胞膜上，介导病毒和细胞膜的融合。然后HIV capsid释放到了细胞质中，然后capsid经过激动蛋白结合并且在微管蛋白上运动，这样capsid运输到了核孔，最后向核孔内释放出病毒粒子中的酶和核酸。随后就发生了逆转录、整合等作用。
DOI 10.1074/jbc.M112.424432
HIV的gp160在病毒包装过程中经过宿主的蛋白酶水解得到gp120/gp41，两者是通过二硫键形成二聚体，然后在形成三聚体。Gp120糖基化程度高，且突变多，相当于亚稳态的gp41埋藏在gp120中，当gp120结合CD4CCR5等分子后，gp41改变而结合细胞膜，最后膜融合，病毒进入细胞。
Viruses 2024, 16(12), 1933; https://doi.org/10.3390/v16121933
再看VSV病毒通过G蛋白结合LDL-R，因为LDL-R天然的作用是结合脂蛋白，结合之后LDL-R和脂蛋白一起通过钙网蛋白被内吞，这样细胞就完成了脂质的摄入；VSV病毒的G蛋白就利用这个“运输的后门”，VSV的G蛋白结合LDL-R之后，细胞内吞进入endosome，VSV病毒进入到endosome中激发endosome中的质子泵而endosome提高了H+浓度，即pH下降。Endosome进一步转为lysosome，因为pH的下降，VSVG蛋白中一些组氨酸在pH中电荷改变导致VSVG结构变化，然后VSVG的疏水端暴露出来结合到lysosome的膜上，类似VSVG在lysosome中“撕开”膜，VSV病毒粒子释放到了细胞质中，随后VSV释放遗传物质，随后整个遗传物质复制、RNA的复制、转录，病毒组装均在细胞质中。
https://doi.org/10.1073/pnas.1618883114
目前慢病毒都将gp120/gp41复合物换成了VSV的病毒的包膜，那么这种改变其实除了改变HIV的靶向性，也改变了病毒的生命周期中的路径。
我们利用VSV.G包装的慢病毒通过逃逸endosome之后，慢病毒capsid依然比较完整，还可以接着依靠Dynein完成运输到细胞核。设想一下，如果VSV.G的融合逃逸能力和融合速度不足够，响应pH下降的速度较慢，那么慢病毒的capsid则会在lysosome中无法快速逃逸，最终LV壳就会破坏而进入不了细胞核。
第二代慢病毒和第三代慢病毒的区别
2nd vs 3rd Generation Lentiviral Systems
2nd vs 3rd Generation Lentiviral Systems | ||
Feature | 2nd Generation | 3rd Generation |
Transfer Plasmid | Can be packaged ONLY by a second generation packaging system that includes TAT | Can be packaged by both 2nd and 3rd generation packaging systems |
Packaging Plasmid | All on one plasmid: Gag, Pol, Rev, Tat | Two plasmids: one encoding Gag and Pol and another encoding Rev |
Envelope Plasmid | Interchangeable: usually encodes for VSV-G | Interchangeable: usually encodes for VSV-G |
Safety | Safe. Replication incompetent: Uses 3 separate plasmids encoding various HIV genes. | Safer. Replication incompetent and always SIN: Uses 4 plasmids instead of 3 and eliminates the requirement for Tat. |
LTR viral promoter | Wild type | Hybrid: 5'LTR is partially deleted and fused to a heterologous enhancer/promoter such as CMV or RSV |
通过上面的对比，我们可以发现，核心区别2nd慢病毒需要TAT，而3nd慢病毒不需要TAT；2nd中的gag、pol、rev、tat在一个质粒，而3nd慢病毒体系中，gagpol为同在一个质粒，而rev在一个质粒中。
那么这个Tat发挥了什么作用了呢？为什么3nd慢病毒就可以不依靠它了呢？
我们先来看看HIV 基因组是如何复制的？
https://viralzone.expasy.org/5061
这个图显示是HIV ssRNA，逆转录得到dsDNA的过程：
首选DNA->RNA转录，需要一个“引子”，比如真核生物转录所需要的引物酶（primase），病毒利用的是宿主的tRNA，tRNA结合到PBS上，tRNA充当了引物，从tRNA的5’-3’合成一段DNA，这段DNA和HIV的LTR的R-U5配对。
然后这个R-U5-tRNA的分子“跳跃”到HIV ssRNA的3’端继续依靠R配对，生成DNA，这里注意写到的RNA引物额外携带了新生的U5。新生的DNA和RNA形成DNA:RNA杂交链，随后RNA基本上被RNaseH降解，而在多聚嘧啶PPT剩余部分RNA充当引物，继续合成DNA，此时DNA携带了U3-R-U5，成为了完整的3‘LTR。随后这个DNA发生”跳跃”到HIV DNA的5‘端，通过形成PBS杂交DNA:DNA，继续得到dsDNA，此时dsDNA的两端都是完整的LTR。
然后我们要知道dsDNA如果整合到宿主基因组后，HIV的U5类似启动子来转录HIV DNA生成RNA。有两个问题：1）5‘LTR的U3启动HIV DNA 转录，但是3’ LTR的U3也会启动下游基因的转录，如果下游是抑癌基因则有风险。2）U3启动HIV DNA转录效率低下。
宿主依靠TAT提高转录水平：当病毒的DNA整合到宿主细胞的染色体后，细胞的转录机器（RNA聚合酶II）会开始读取病毒基因，合成病毒RNA。遇到“卡顿”：但在没有Tat的情况下，这个转录过程在病毒基因的起始阶段非常缓慢、低效，经常中途停止，只能产生非常短小的RNA片段。这就像一辆车刚启动就熄火，无法跑完全程。Tat蛋白会特异性结合到这些刚合成出来的、短小的病毒RNA的一个特殊区域，称为 TAR。Tat-TAR的结合就像一个“救援信号”，它会招募一大群宿主细胞的辅助因子（如P-TEFb）。这个复合体（Tat + TAR + 宿主因子）能极大地提升RNA聚合酶的“工作效率”。
举例子：
HIV野生型的基因组ssRNA结构
这里需要特别注意R-U5，5端独特序列（Unique to the 5’ end）；U3-R中的3‘ 端独特序列（Unique to the 3’ end）。
当HIV基因组整合到宿主基因组后，前病毒就变成了宿主细胞的一部分(即DNA序列)。这时，dsDNA序列的5端是U3-R-U5-genome-U3-R-U5(见上HIV 基因组逆转录的示意图).
HIV整合后转录时，U3区域发挥转录激活启动子的作用：U3区域内包含了许多关键的调控序列，可以结合宿主细胞的转录因子（如NF-κB, SP1等），并且这个转录活性依然不足够，病毒自身的Tat蛋白（通过TAR元件，位于R区）。当这些因子结合到U3区域后，它们会招募细胞的RNA聚合酶II，启动病毒基因的转录。
第二代慢病毒的质粒图谱
Addgene的pWPT-GFP (Plasmid #12255)
这个是二代2nd病毒目的载体。5’LTR是完整的LTR(即U3-R-U5)，truncated 3’LTR(R-U5)缺少U3。如果这个载体进行慢病毒包装，那么就相当于HIV在宿主基因中转录出来ssRNA包装进入慢病毒中，ssRNA的结构是：R-U5-GOI(Gene of Interest)-R。在这个过程中，需要完全依靠包装载体自带的5’LTR的U3启动转录，所需需要加入TAT协助转录得到更多的ssRNA，提高病毒产量。
当这个ssRNA经过逆转录后得到dsRNA，其结构是：R-U5-GOI-R-U5。这样目的基因就依靠自身的启动子转录（比如这里的EF1A），而3’LTR并没有U3，所以也不会对下游基因产生激活转录。
第三代慢病毒的质粒图谱
Addgene的pLVpuro-CMV-N-EGFP(Plasmid #122848)
这个是二代3nd病毒目的载体。5’LTR是truncated LTR(即R-U5)，3’LTR(U3.truncated-R-U5)，根据生物过程，这个质粒转染进入细胞，因为5LTR缺少U3，他是无法转录出ssRNA的，那么怎么办呢？这里额外加入外源强启动子RSV-promoter等转录出的ssRNA。这个ssRNA的结构是R3-U5-GOI-U3.truncated-R，因为这个U3.truncated很短已经缺少激活能力，所有也不会激活下游基因。因为慢病毒的5’LTR已经缺少U3且用了外源强启动子, 那么自然也就不需要TAT了。
