本文来源于微信公众：生化寻踪 作者：生化寻踪
过去十几年中，FDA批准的所有ADC都是由不同数量的药物附着在单克隆抗体不同位置的ADC混合而成的。目前业界已经开发了一系列新的偶联策略，旨在控制有效载荷的链接位置和数量，同时保持结构完整性和同质性。
目前，偶联技术可分为2类：①利用抗体序列中天然的具备反应活性的氨基酸残基来介导的偶联技术，包括抗体表面赖氨酸的侧链氨基和链间二硫键还原后的巯基；②利用基因工程技术、化学修饰或酶修饰等在抗体特定位点引入可供反应的基团，再偶联载荷毒素，实现特定位点偶联，此类偶联包括工程化半胱氨酸定点偶联技术、非天然氨基酸定点偶联技术、 酶介导的定点偶联技术、糖链介导的定点偶联技术等。
第一代抗体偶联技术（随机偶联）
传统的 ADC 利用抗体赖氨酸的氨基或打开链间二硫键获得的半胱氨酸的巯基进行偶联。一个抗体分子包含了 80 ~ 90 个赖氨酸，偶联可能会发生在将近 40 个不同赖氨酸残基上，打开链间二硫键会得到多个半胱氨酸残基，同时破坏了抗体分子的完整性，因此传统的 ADC 是高度异质混合物，其均一性差，稳定性低，影响药效及治疗窗。
第二代抗体偶联技术
通过引入生物正交分子到抗体中，然后利用引进的特殊位点进行定点偶联，但是这些特殊位点的引进往往需要对抗体进行改造，这可能会改变抗体的部分性质，甚至会改变抗体的折叠或者稳定性。
1. 引入反应性半胱氨酸（THIOMAB技术）
Genentech最早利用了一种名为THIOMAB的定点偶联技术，通过基因工程在抗体的特定点插入半胱氨酸残基，在还原性条件下，引入的半胱氨酸及链间的二硫键被还原，在CuSO4的作用下氧化并再次形成二硫键，形成位点专一的抗体偶联药物。
Thiomab 技术，工程化引入半胱氨酸，既不会干扰免疫球蛋白的折叠和组装，也不会改变抗体抗原的结合模式，获得的ADC药物既保留了其体内抗肿瘤活性，还提高了耐受性、降低了系统毒性。该技术具有高均一性、较好的反应活性和稳定性等优点，缺点是需要基因修饰，通常DAR 2。
基于此，Seattle Genetics 和 Spirogen 开发了一种类似的技术，称为 MAIA，通过在 mAb 关键区域的 239 位引入丝氨酸-半胱氨酸突变，用于其 PBD 二聚体的生物缀合。
2. 引入非天然氨基酸
通过在抗体的原始序列中人工加入非天然氨基酸，使其在抗体表面呈现出可方便偶联的特异性位点，从而获得位点确定、DAR值均一的ADC。该偶联技术独特之处在于可以随意突变非天然氨基酸，并且得到任意DAR值的ADC，缺点是需要基因修饰、抗体表达量低、非天然氨基酸序列引起免疫原性和非天然氨基酸的疏水性引起聚集。
引入的非天然氨基酸通常为乙酰苯丙氨酸、叠氮基甲基-L-苯基丙氨酸和叠氮赖氨酸。非天然氨基酸上带有的酮基、叠氮基官能团可与药物连接子发生化学反应，获得 DAR 均一的 ADC。
3. 酶法偶联
抗体和小分子药物可以利用酶法实现定点偶联。酶法偶联具备定点偶联的优势，但也存在引入额外序列而造成免疫原性的潜在弊端。因此，在产品开发过程中，需要对生成的 ADC 进行完善的免疫原性评估以确保其安全性。
10.13748/j.cnki.issn1007-7693.20232887
第三代抗体偶联技术
第二代抗体偶联技术虽然可以实现对抗体进行定点偶联，但是需要对抗体进行特殊改造，这在一定程度上可能会给ADC药物的开发带来一些新的挑战，因此有研究者开始考虑在不改变抗体完整的基础上，对天然的抗体进行位点特异性偶联。第三代偶联技术主要是聚焦于选择独特的氨基酸位点并利用独特的分子或者通过邻近效应进行定点偶联，其主要分为以下4种：1）链间二硫键改造；2）糖基修饰；3）化学选择性的修饰；4）基于邻近效应的修饰。
1. 二硫键重桥
二硫键重桥，又名 Disulfide re-bridging，是利用半胱氨酸选择性交联试剂（如TECP或DTT），将IgG1抗体中4个链间二硫键还原，随后使用双反应试剂在多肽链重新连接的同时，完成小分子有效载荷的安装或抗体的进一步修饰。通过共价重新连接半胱氨酸残基，既维持了二硫键的稳定作用，同时实现每个二硫键链接一个有效载荷的受控偶联。
该偶联方式具有高均一性、不影响抗体的空间结构、通用的氨基酸序列与糖基化修饰等优点，缺点是链内错误桥接，通常DAR 4。
根据偶联试剂的不同分类分为4类：单/双砜类试剂； 3,4-二取代马来酰亚胺；二溴哒嗪二酮和; 二乙烯基嘧啶。
2. 糖基偶联
IgG型抗体中存在两个保守的糖基化位点N297，该位点位于CH2结构域，远离抗体结合抗原的功能结构域，因此利用该位点进行偶联不会对抗体的结合功能造成影响。
ADC的糖基化偶联技术不改变抗体的结构，无需进行抗体工程化改造、不引入非天然氨基酸和特定的氨基酸序列突变以便进行偶联。目前可用Fc端糖基化偶联技术有：糖基氧化的修饰、糖代谢工程、酶工程等。总的来说，利用该糖位点的偶联，主要是通过在糖基上引入一个新的反应基团，然后再利用相关试剂进行定点偶联。
2.1 基于糖基的氧化的修饰
Fc端糖基的核心可以通过选择性高碘酸盐氧化修饰，然后与酰肼毒素小分子反应，形成具有完整免疫反应性的腙连接缀合物。这个技术早在gemtuzumab ozogamicin开发的时候就曾使用过，但抗体的敏感性导致了在氧化过程中抗体活性的损失，所以才采用的AcBut连接子的赖氨酸随机偶联技术。
2.2 代谢工程化修饰抗体寡糖
通过代谢工程修饰抗体寡糖，在细胞培养基中掺入岩藻糖类似物6-硫代过乙酸盐，以这种方式在糖基的核心处引入巯基，巯基可以作为使用马来酰亚胺化学连接连接子-载荷的锚定点。
2.3 酶工程化修饰抗体寡糖
利用糖基转移酶，主要是通过在糖基上引入一个新的反应基团，然后再利用相关试剂进行定点偶联。目前拥有酶工程糖基化偶联技术的公司也有多家，包括Syniffix，康宁杰瑞和糖岭生物等，但是具体使用的酶和linker接头均有所不同。
根据岩唐生物披露信息，其YTConju™技术平台通过对抗体Fc区域保守的糖基化位点进行酶化学法改造，并利用高效的岩藻糖基转移酶和改构后的岩藻糖衍生物实现了“一步法”偶联。
康宁杰瑞研发了具有自主知识产权，基于抗体CH2结构域糖链的定点偶联技术，采用一酶两步法，核心步骤为在β-1,4-半乳糖基转移酶的催化作用下，UDP-GalNAz被转移至抗体的末端已酰葡萄糖胺上，从而引入叠氮基团，进而为payload通过点击化学的方法偶联至抗体上。但对于抗体糖链末端的结构如何做到统一（抗体制备过程控制策略），是否需额外修饰，并无太多信息披露。
康宁杰瑞官网
Synaffix公司创建的GlycoConnect™技术，包括用EndoS修剪Fc糖链，随后转移GalNAz或叠氮-半乳糖基团，以及最终点击连接子-载荷。结合多种连接子-载荷选项，这项技术已被多家合作公司用来生成DAR 2的均质gsADC。
3. 化学选择性修饰（略）
4. 邻近诱导抗体偶联技术
探针和蛋白质的特定天然残基（例如，赖氨酸、半胱氨酸、丝氨酸）之间进行选择性反应的邻近的偶联方法正在成为一类重要的抗体偶联方法。这些策略能够制备位点特异性抗体偶联物，而无需额外的抗体工程或额外修改。目前基于邻近的偶联的努力方向主要集中在新的邻近诱导化学以及对抗体结构和功能的破坏较小的抗体结合剂上。
10.13748/j.cnki.issn1007-7693.20232887
5. 其他偶联技术
赖氨酸与半胱氨酸作为广泛使用的靶标，在化学反应方面具有显著优势。然而，异质性问题对其药效性质产生了负面影响，进而影响毒性表现。基于内源性氨基酸的化学替代方法。其中，因酪氨酸、色氨酸、组氨酸的芳香族侧链表现出独特的反应性和选择性，多种基于芳香族侧链改性的化学技术应运而生。
5.1 蛋氨酸（ReACT）
蛋氨酸是一种主要负责保护人体免受氧化应激的氨基酸。因此，与其他氨基酸残基相比，其功能化不太可能损害蛋白质的功能。另一个优势是蛋氨酸的丰度较低(约1.8%)，这降低了特定标记的概率。但发现所得蛋氨酸偶联物的稳定性一般，需要进一步优化才能成功应用于ADC 领域。
5.2 酪氨酸
广泛的双正交标记策略是基于酪氨酸(Tyr)的苯酚侧链上的选择性化学。酪氨酸出现在蛋白质序列的频率中等 (自然丰度为3.3%)，从而为其独特的苯酚侧链的位点选择性标记提供了机会。尽管酪氨酸通常部分埋藏在蛋白质表面，但它也可以参与氢键，并且由于其氧化还原潜力，可以形成酪氨酸自由基，使电子转移。因此，酪氨酸残基经历了高度多样化的生物修饰，如硝化、氧化、交联、AMP化、卤化或糖基化。
