萤光素酶与萤光素底物反应产生的发光现象多应用于生物发光成像。利用萤光素酶基因标记细胞，注射萤光素底物后检测萤光强度，可实时监 测目的细胞的生长状况与药物使用效果。由于萤光反应中还涉及ATP，因而也可利用ATP对体系的影响指示能量或生命状态。
一，D-萤光素钾盐的原理
萤光素酶在ATP、Mg2+和O2的条件下催化D-萤光素钾盐进行氧化脱羧反应，发出平均波长为560nm的蓝绿色荧光。当萤光素钾盐过
量时，产生的光量子数与萤光素酶的浓度呈正相关性。由于其方便检测、定量准确、在生物技术领域有着非常广泛的应用，特别是体内活体成
像领域和报告基因技术领域。
二，D-萤光素钾盐的使用方法
1. 溶液的制备
D-荧光素钾盐的溶液可以用于染色、标记、检测等多种应用。
制备D-荧光素钾盐溶液的方法：
a.首先称取适量的D-荧光素钾盐，加入适量的去离子水中后进行均匀搅拌；
b.使用过滤膜将溶液过滤，除菌。
c.将D-荧光素钾盐溶液调节至所需要的浓度。
2. 染色实验过程
D-荧光素钾盐可以用于细胞染色、组织染色等染色实验，实验方法如下：
a.首先将细胞或组织样本固定在载玻片上。
b.然后加入适量的D-荧光素钾盐溶液，使试剂溶液可以覆盖样本。
c.在黑暗条件下可以孵育一段时间，使D-荧光素钾盐充分渗透入细胞或组织中。
d.使用PBS缓冲液洗涤样本，去除多余的D-荧光素钾盐。
e.在显微镜下观察样本，观察样品的荧光信号。
3. 实验标记
D-荧光素钾盐也可以用于标记蛋白质、核酸等生物分子。
实验标记方法：
a.首先将蛋白质或核酸与d-荧光素钾盐共同孵育。
b.再用凝胶电泳等方法分离标记后的生物分子。
c.最后在荧光显微镜下观察标记后的生物分子即可。
4. 检测方法
D-荧光素钾盐可用于检测生物分子的存在和浓度。
D-荧光素钾盐检测方法：
a.将d-荧光素钾盐与待检测的生物分子进行共同孵育。
b.用凝胶电泳等方法分离孵育后的混合物。
c.在荧光显微镜下观察荧光信号，即可判断生物分子的存在和浓度。
三，逐典D-萤光素钾盐优势
1.高纯度（HPLC验证纯度≥99%)
2.优异的生物发光性能
3.高溶解度（>40mg/ml)
四，应用场景
D-荧光素钾盐在不同领域具有多种应用场景。其中包括蛋白表达研究、抗肿瘤或抗病毒药物研究以及mRNA疫苗开发等。
蛋白表达研究：将Luc基因插入需要研究的蛋白中，可用于定量目标蛋白在实验动物体内的表达情况。
抗肿瘤或抗病毒药物：在肿瘤细胞或病毒中导入Luc基因，建立肿瘤或病毒感染小鼠模型，注射药物后，通过活体成像技术观测肿瘤大小或病毒感染的变化。
mRNA疫苗开发：在mRNA中插入Luc基因，脂质体包裹后注射实验动物后，可通过活体成像技术可观测疫苗的免疫效果。
五，应用案例分享
六，常见问题答疑
Q:D-萤光素钾盐的纯度是多少？纯度大小对实验有影响吗？
A:D-萤光素钾盐纯度≥99 %，萤光素纯度越高，相应污染物含量越低，相反则越高，污染物浓度过高将抑制某些酶和细胞中的生物学过程，可能会给实验结果带来偏差，并且可能会对实验动物造成伤害。
Q:D-萤光素钾盐溶解度是多少？其溶液稳定吗？
A:D-萤光素钾盐溶解度在40 mg/ml以上，其水溶液短期内存放于-80℃，对实验效果没有明显影响。对于部分条件较敏感的实验，为了控制实验中的可变因素，推荐反应液新鲜配制。例如，荧光素酶过低、非最适的反应条件等都需要高质量的底物才能进行反应。
Q:D-萤光素钾盐的建议用量是多少？
A:活体成像：以10 μL/g体重确定注射量。每只小鼠接受150 mg D-萤光素钾盐/kg体重（如对于体重为10 g的小鼠，需要注射100 μL以提供1.5 mg D-萤光素钾盐）。
体外成像：一般使用150μg/ml的工作液用于体外细胞成像。
Tips: 注射方式、动物类型以及体重等都会影响信号的发射，需要适当摸索，待萤光信号达到最强稳定平台期，再用相应仪器进行成像分析。
Q:配置好的D-萤光素钾盐溶液如何储存？
A:工作液现配现用，理想情况下，配置好的储存液可于-20℃储存较短时间。如有必要，萤光素溶液可在-20℃储存长达3周。
Tips: 上述溶液在任何一种温度长时间贮存下都有可能导致信号退化哦！
Q:萤光素（酶）底物的形式有哪些？
A:分为D-萤光素游离酸、D-萤光素钾盐和D-萤光素钠盐，由于水溶性高，因此钾盐和钠盐通常是最通用的两种检测底物，其中又以钾盐作为活体动物检测使用的主要形式。
Q:如何确定不同模型的峰值信号时间?
A:生物发光信号的动力学具有组织依赖性。建议每5-10min对动物进行一次成像，最多40 min，为每个新模型创建一个动力学曲线。(常见信号峰值时间点在10-15 min左右，萤光反应发光一般在30 min后衰减，3 h后完全消失。)具体详见逐典D-萤光素钾盐说明书“萤光素动力学曲线制备”。
Q:萤光素底物可以透过血脑屏障吗？
A:萤光素底物约280 Da，萤光素的水溶性和脂溶性都非常好，很容易穿透细胞膜和血脑屏障。
Q:萤光素酶的表达稳定性如何？
A:萤光素酶基因能够通过稳定筛选等过程插到细胞染色体内，当细胞进行分裂、转移、分化从而进行持续稳定的表达，萤光素酶的半衰期约为3 h，故只有活细胞才能持续表达萤光素酶。
