本文来源于微信公众：抗体圈 作者：小编
摘要：在单克隆抗体（mAb）的生物制药生产过程中，宿主细胞蛋白（HCPs）作为关键的工艺相关杂质，其有效控制和去除对于确保药物稳定性及患者安全至关重要。本研究借助基于质谱（MS）的先进分析技术，对五种不同细胞系产生的七种单克隆抗体下游处理过程中的 HCPs 进行了系统追踪。研究发现，尽管 HCPs 在不同处理步骤中的身份存在显著差异，但收获液中最丰富的 HCPs 在种类和数量上表现出广泛的共性。通过对比 SWATH 和 DDA 两种质谱技术，证实 SWATH 在 HCPs 定量重复性上具有明显优势，尤其适用于低丰度蛋白的检测。此外，研究还揭示了 HCPs 丰度、抗体 - 蛋白相互作用等多重因素对其在纯化步骤中持久性的影响，为优化 HCPs 控制策略提供了重要依据。
HCP残留检测是生物制药质量安全的生命线，更是实现工艺优化的核心关卡。7月5日（周六）13：30-18：00，诺唯赞联合生物制品圈在苏州发起以“生物制品宿主细胞残留控制：工艺优化与检测技术研讨”为主题的线下沙龙活动，深度聚焦宿主蛋白残留检测工艺优化与检测技术创新，共筑生物制药质量安全防线。
一、研究背景：HCPs—— 单克隆抗体制备中的 “隐形挑战”
（一）HCPs 的关键影响与检测需求
在生物制药领域，单克隆抗体凭借其高度特异性和疗效，已成为治疗性蛋白中的主导产品。这些抗体通常通过中国仓鼠卵巢（CHO）细胞重组表达，但 CHO 细胞在产生目标抗体的同时，也会释放大量自身蛋白，即宿主细胞蛋白（HCPs）。这些 HCPs 若未被有效去除，可能会引发免疫反应、影响药物稳定性，甚至威胁患者安全。因此，在单克隆抗体制备的下游处理中，HCPs 的去除和监控是至关重要的环节。
传统上，酶联免疫吸附测定（ELISA）是检测 HCPs 的常用方法，但该方法存在明显局限性。例如，样品稀释时的非线性响应以及对 HCPs 覆盖的不完整性，可能导致检测的精度和准确性受损。随着质谱技术的发展，液相色谱 - 质谱（LC-MS）等正交方法为 HCPs 的全面定量分析提供了新途径，能够无限制地检测样品中的所有 HCPs。
（二）质谱技术在 HCPs 分析中的进展
过去十年间，基于质谱的蛋白质组学分析技术取得了显著进步。数据非依赖采集（DIA）和数据依赖采集（DDA）方法的应用，使得 HCPs 的个体识别和定量测量成为可能。特别是 DIA 的一种变体 —— 顺序窗口采集所有理论碎片离子光谱（SWATH），已成功应用于 CHO 细胞内蛋白和单抗下游处理池的高灵敏度、高重复性定量分析。SWATH 技术能够对样品中超过检测限的每一个肽段和碎片进行表征，具有极高的重复性，为 HCPs 的精准分析提供了强有力的工具。
然而，尽管已有诸多研究报道了 HCPs 在单抗纯化过程中的清除情况，但对于不同细胞系、不同上游和下游处理条件下 HCPs 模式的相似性和变异性，仍缺乏全面深入的了解。本研究正是基于这一现状，旨在通过先进的 DDA 和 SWATH 方法，拓展对 HCPs 持久性的认识，为优化单抗生产工艺提供科学依据。
二、研究方法：多维度技术整合的 HCPs 分析策略
（一）样品制备与实验设计
本研究涉及七种单克隆抗体的四个关键工艺流样品，包括收获液（HCCF）、蛋白 A 洗脱液以及两个抛光池样品，这些样品由基因泰克和默克公司提供。七种单抗分别由五种不同的 CHO 细胞系表达，其中单抗 1、2、3 来自细胞系 A，单抗 4、5、6、7 分别来自细胞系 B-E。同时，研究还获取了 ELISA 测定的总 HCP 浓度数据，为后续分析提供参考。
（二）质谱分析技术路线
1. 蛋白质消化与样品前处理
对于 HCCF 样品，采用标准消化（变性条件）方法：将样品中的蛋白质在 100 mM 三乙胺碳酸氢盐（TEAB）中调整至 50 μg，依次进行变性、还原和烷基化处理，使用胰蛋白酶在 37℃下消化 16 小时，消化产物经酸化后用 OMIX C18 pipette tips 进行脱盐处理。而对于纯化样品（蛋白 A 洗脱液和抛光池样品），则采用 native 消化（非变性条件）：样品在 pH 6.0 条件下用 25 mM Tris 缓冲液稀释，以 1:400 的酶/底物质量比加入胰蛋白酶消化，随后进行 DTT 处理、离心过滤和酸化等步骤。
2. LC-MS/MS 数据采集
在 Sciex TripleTOF 6600 质谱仪上，HCCF 样品采用 SWATH 模式进行定量分析，先进行 MS1 全扫描，再进行 64 次 MS/MS 采集；纯化样品则采用 DDA 模式，对前 30 个前体离子进行碎裂。在 Thermo Q-Exactive High Field X 质谱仪上，HCCF 样品通过 DDA 模式进行分析，采用 140 分钟的线性梯度分离肽段，对前 40 个 hits 进行 Orbitrap 检测。
3. 蛋白质鉴定与定量
使用 ProteinPilot 软件对 DDA 数据进行处理，搜索 CHO RefSeq 2019 数据库，结合 Paragon 算法进行蛋白质鉴定。对于 SWATH 数据，通过生成光谱库，利用 Skyline 软件进行峰提取和积分，再通过 MSstats 进行蛋白质定量，以酵母醇脱氢酶（ADH）作为内标进行归一化处理。
三、研究结果：HCPs 在单抗生产过程中的动态特征
（一）HCPs 在不同工艺阶段的清除概况
如表 1 所示，七种单抗的 HCCF 样品中，ELISA 测定的总 HCP 浓度范围从低于 105 ppm 到超过 106 ppm，而 SWATH 模式下定量的 HCP 数量在 525 到 1410 之间。其中，单抗 7 的 HCCF 不仅 ELISA 测定的总 HCP 浓度最高，SWATH 定量的 HCP 数量也最多。
经过蛋白 A 层析后，总 HCP 浓度显著降低（对数减少值 LRV 为 2-4），但仍能检测到数百种 HCPs。值得注意的是，IgG4 亚型的单抗 3 和 7 的蛋白 A 洗脱液中检测到的 HCP 数量相对较少。而后续的两个抛光步骤则进一步大幅提高了产品纯度，在抛光 2 池中最多仅检测到 2 种 HCPs，最终滴度极低或低于 ELISA 定量限。
（二）SWATH 与 DDA 技术的 HCPs 定量比较
如图 1 所示，对于七种单抗的 HCCF 样品，SWATH 定量的 HCP 数量普遍多于 DDA。以单抗 7 为例，SWATH 定量了 1410 种 HCPs，而 DDA 仅定量了 631 种。进一步分析发现，73-94% 的 DDA 检测到的 HCPs 也存在于 SWATH 数据中，但 DDA 仅覆盖了 SWATH 数据中 41-70% 的 HCPs。
在定量重复性方面，SWATH 表现出明显优势。如图 2 所示，SWATH 测定的 HCPs 中，仅 8-15% 的变异系数（CV）超过 20%，而 DDA 模式下，这一比例高达 45% 至 80% 以上。以单抗 2 的 HCCF 样品为例，DDA 测定的 HCPs 中，42% 的 CV 超过 50%，是其他单抗的两倍左右。
如图 3 所示，在单抗 7 的 HCCF 中，SWATH 和 DDA 测定的 HCP 丰度总体上较为接近，但仍有部分 HCPs 存在显著差异。例如，肌动蛋白在 DDA 中是丰度较高的 HCPs 之一，但在 SWATH 中仅在少数 HCCF 样品中检测到极低水平，这可能与样品前处理过程中肌动蛋白的损失或不完全消化有关。
（三）HCCF 中 HCPs 的丰度特征与共性分析
对来自细胞系 A 的单抗 1-3 的 HCCF 样品分析发现，共定量了 1157 种 HCPs，其中 474 种为三者共有。如图 4 所示，在最丰富的 20 种 HCPs 中，有 5 种在三种 HCCF 中均稳定存在，基底膜特异性硫酸乙酰肝素蛋白聚糖核心蛋白是其中最丰富的。
进一步分析 HCPs 丰度与检测一致性的关系发现，如图 5 所示，在单抗 1 的 HCCF 中，三种 HCCF 共有的 HCPs 平均丰度比仅在单抗 1 中检测到的 HCPs 高 5 倍以上。这表明 HCPs 的丰度可能与其定量测量的重现性相关，丰度较高的 HCPs 更易被一致检测到。
对于来自细胞系 B-E 的单抗 4-7 的 HCCF 样品，SWATH 分析共定量了 1471 种 HCPs。结合七种单抗的 HCCF 数据，发现共有 415 种 HCPs 在所有五种细胞系中均存在，如图 6 所示。这些 “核心” HCPs 的丰度分布如图 7 所示，覆盖了 4-5 个数量级，与 Falkenberg 等人的研究结果相似，表明 HCPs 的丰度模式在不同细胞系和上游条件下具有一定的保守性。
（四）HCPs 在下游处理中的持久性分析
如图 8 所示，蛋白 A 洗脱液中检测到的 HCPs 与对应的 HCCF 样品既有重叠，也有差异。对于七种单抗的蛋白 A 洗脱液，未在 HCCF 中检测到的 HCPs 占比在 9-53% 之间，这可能归因于蛋白 A 样品前处理中使用的 native 消化方法具有更高的动态范围。
进一步分析 HCPs 丰度与持久性的关系发现，如图 9 所示，在 HCCF 中丰度较高的 HCPs 更有可能在蛋白 A 洗脱液中被检测到。然而，也有一些低丰度 HCPs 在所有单抗的蛋白 A 洗脱液中均持续存在，这表明除丰度外，其他因素如 HCP - 抗体相互作用也可能影响 HCPs 的持久性。
研究还鉴定出 34 种在所有七种蛋白 A 洗脱液中均存在的 HCPs，如表 2 所示。这些 HCPs 的等电点（pI）范围广泛，从 4.8 到 9.7，这可能解释了为什么单一的离子交换层析步骤往往无法去除所有 HCPs。其中，簇蛋白、内质网伴侣 BiP 前体等六种 HCPs 在至少两种 HCCF 中属于最丰富的 10 种 HCPs，且 14 种属于 HCCF 中平均丰度前 100 的 HCPs。
在抛光池样品中，如表 3 所示，抛光 1 池共检测到 25 种 HCPs，其中 5 种在至少三种单抗中存在；抛光 2 池仅检测到 5 种 HCPs。过氧化物酶 - 1、延伸因子 1-α1 等 HCPs 在多个抛光池中持续存在，且这些 HCPs 大多在蛋白 A 洗脱液中也有广泛检测，表明它们可能通过与抗体结合等机制在纯化过程中持续存在。
四、讨论：HCPs 控制的关键因素与技术挑战
（一）HCPs 丰度的多重影响
本研究证实，HCPs 的丰度在其清除和蛋白质组学表征中扮演着多重角色。一方面，丰度较高的 HCPs 在质谱定量中具有更高的重现性，尤其是在 DDA 模式下，低丰度 HCPs 的检测精度明显降低。另一方面，HCPs 的丰度与其在下游处理中的持久性密切相关，丰度较高的 HCPs 更有可能在蛋白 A 洗脱液等步骤中持续存在。
然而，丰度并非唯一决定因素。研究中观察到一些低丰度 HCPs 也具有持久性，这提示 HCP - 抗体相互作用、HCP 的物理化学性质（如等电点、疏水性）等因素也可能影响其清除效率。例如，某些 HCPs 可能通过与抗体形成复合物，逃避蛋白 A 层析的清除作用。
（二）质谱技术的应用前景与局限性
本研究对比了 SWATH 和 DDA 两种质谱技术在 HCPs 分析中的表现，结果表明 SWATH 在定量重复性和检测范围上具有明显优势，尤其适用于复杂生物样品中 HCPs 的全面分析。SWATH 技术的高重复性使其成为 HCPs 定量的可靠工具，而 DDA 则在新 HCPs 的发现中具有一定优势。
尽管如此，质谱技术在 HCPs 分析中仍面临一些挑战。例如，不同实验室、不同仪器和不同工作流程之间的差异可能导致结果的不一致性。此外，对于膜蛋白、细胞骨架蛋白等难溶性 HCPs，当前的样品前处理和消化方法可能存在局限性，导致其检测效率低下。
（三）HCPs 控制策略的优化方向
基于本研究结果，优化 HCPs 控制策略可以从多个角度入手。首先，在工艺开发阶段，应充分考虑 HCPs 的丰度和持久性特征，针对性地设计纯化步骤。例如，对于丰度较高且难以清除的 HCPs，可以考虑增加专门的清除步骤，如亲和层析或离子交换层析的组合。
其次，加强 HCPs 与抗体相互作用的研究，有助于开发更有效的清除策略。通过鉴定与抗体结合的 HCPs，可以设计特异性的配体或条件，促进这些 HCPs 的去除。此外，优化样品前处理和质谱分析方法，提高对难溶性 HCPs 的检测能力，对于全面了解 HCPs 谱图、指导工艺优化也至关重要。
五、结论与展望：迈向 HCPs 精准控制的生物制药新时代
本研究通过整合先进的质谱技术，全面解析了不同细胞系和处理条件下 HCPs 在单克隆抗体制备过程中的动态特征。研究结果表明，HCPs 的丰度、与抗体的相互作用等多重因素共同影响其在下游处理中的持久性，而 SWATH 等质谱技术为 HCPs 的精准定量和表征提供了强有力的工具。
展望未来，随着质谱技术的不断进步和蛋白质组学分析方法的完善，HCPs 的表征将更加全面和精准。这不仅有助于深入理解 HCPs 在单抗生产中的行为机制，还将为开发更高效的 HCPs 控制策略提供科学依据。此外，结合人工智能和机器学习技术，有望建立 HCPs 预测模型，实现从细胞系开发到下游纯化的全流程 HCPs 风险控制，推动生物制药行业向更加安全、高效的方向发展。
