一，基本概念
报告基因：基因表达变化或者与基因表达变化相关的细胞事件的一个指示剂。通常是一种编码易被检测的蛋白质或酶的基因，其表达产物非常容易被鉴定。
荧光素酶（luciferase）：一类能够产生生物发光信号的酶的统称，其中最有代表性的是从甲虫中分离得到的萤火虫荧光素酶和从海肾中分离得到的海肾荧光素酶。萤光素酶可以催化自身底物氧化，反应中一部分能量以光子形式被释放，即生物发光信号。萤光素酶是理想的报告基因，因为哺乳动物细胞中不含内源性萤光素酶，一旦转录完成立刻就生成功能性的萤光素酶，同时在所有的化学发光反应中，它的光产物具有最高的量子效率，检测灵敏度高。
二，荧光素酶促进生物发光的机制
以萤火虫萤光素酶的生物发光反应为例（主报告基因）：
萤光素酶是一种作为化学反应催化剂的蛋白质，能在萤光素、ATP和其它细胞离子存在的条件下促进光的产生。化学反应本身包括两个步骤：
1. 在萤光素酶存在的条件下，萤光素+ATP生成萤光素化腺苷酸+ ADP。
2. 将萤光素化腺苷酸+氧气转化为氧化萤光素+AMP以及光。
萤火虫荧光素酶一般是作为主报告基因，将目的基因构建在该载体上，从而反应目的序列的作用结果，因此根据我们的实验目的，可以针对此质粒进行改造，载体的工作原理如下图所示：
海肾荧光素酶催化的发光反应需要腔肠素和O2的参与，发光颜色为蓝色。
海肾荧光素酶通常作为内参报告基因，来标定检测用报告基因的测量结果，从而达到有效地减少实验误差的目的，载体的工作原理如右图所示：
三，实验方法
1. 用生物信息学方法分析并预测启动子区可能的转录因子结合位点（若目标是检测miRNA 及其靶基因的靶向作用，则需要预测两者结合位点）。
2. 设计引物用 PCR 法从基因组 DNA 中克隆所需的靶启动子片段，将此片段插入到荧光素酶报告基因质粒（如 pGL3-basic）中。
3. 克隆报告基因载体：质粒的提取、转化。
4. 工具细胞培养和转染：293T细胞。
细胞培养：生长 90%汇合的细胞进行传代培养。
细胞铺板：取对数生长期的细胞制成细胞悬液，计数，接种于 96-well 培养板中。37℃、5% CO2培养箱培养至细胞融合度达到约 60%。
瞬转24h；给药24h。（瞬时转染（Transient Transfection）与双萤光素酶报告基因检测；稳定转染（StableTransfection）与单萤光素酶报告基因检测）
5. 实验室用报告基因检测方法：
1)用1ml注射器弃去96孔板中的培养基
2)取Reporter lysis 5×Buffer 裂解液，稀释5倍（1.5ml+6ml纯水），混匀
3)用排枪+ 100 μl/孔
4)摇床上震荡30min
5)洗净白板（全白色不透光平板（White Plates, Solid Bottom）、吹干，排枪吸取50μl/孔加至白板中
6)配底物：1ml+2.5ml纯水，注意避光
7)避光用排枪+底物50μl/孔
8)立即用酶标仪检测（特异生物学反馈+非特异生物学反馈）
• 发光检测仪（Luminometer），或者带有发光检测模块（使用化学发光，无需设置波长）
6. β-半乳糖苷酶检测（β-Gal）（内参）
（报告基因A检测剩下在原96孔板中的用作β-Gal检测）
1)原96孔板中+ β-Gal检测试剂50ul/孔
2)盖上盖子用保鲜膜封住防止蒸发，轻拍混匀，放于37℃敷箱30min，样品孔会呈浅黄色
3)+150ul/孔β-半乳糖苷酶反应终止液，混匀
4)分光光度计检测420nm处波长（非特异生物学反馈）
7. 数据处理：
主报告基因与内参基因的相对活性比值作为相对光强度RLU，再作归一化处理。
CHASELECTION逐典萤光素酶报告基因检测试剂盒旨在准确、灵敏、高效地测定萤火虫萤光素酶活性，应用高通量药物筛选、药物活性检测、大规模启动子功能测定、信号通路等研究。
逐典萤光素酶报告基因
针对报告基因检测不同的侧重需求，逐典推出了3种检测系统。
逐典萤光素酶报告基因优势：
1. 检测灵敏度高，信号稳定性好
HEK293-NFK B-LUC细胞加入梯度稀释的TNF 在37C、5%CO条件下刺激6小时后,分别用增强型、超敏型、稳定型检测试剂进行信号检测。
2. 操作方便
仅需将底物和萤光素酶检测缓冲液混合后直接加入到细胞即可。
3. 稳定性好
同时在10次反复冻融实验中，逐典全系列报告基因检测试剂盒显示出较强的稳定性。
